Name: an optical assay for synaptic vesicle recycling in cultured neurons overexpressing presynaptic proteins
Uploaded: 2018-06-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins at JoVE.com

אנו מודים אירמגרד וייס לסיוע טכני מומחה. עבודה זו נתמכה על ידי DFG באמצעות האשכול המצוינות מיקרוסקופ במטווח ננומטר ופיזיולוגיה מולקולרית של המוח (CNMPB, B1-7, סמטת).

אין מחקרים עם בעלי חיים נערכו. ניסויים המערבות בעלי חיים לאללה לקבל תא תרבויות אושרו על ידי רשויות מקומיות להגנת בעלי חיים (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin גטינגן) תחת האישור למספר T10/30. הניסויים נערכו עם הפרוטוקולים המאושרים.
1. תרבית תאים בהיפוקמפוס ראשי
<ol><li>להכין את התרבות התא ה...

<ol>
	<li>Koh, T., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin+I,+a+Ca2++sensor+for+neurotransmitter+release.">Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release.</a> Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).</li><li>Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Does+Synaptotagmin+Trigger+Neurotransmitter+Release.">How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release.</a> Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).</li><li>Perin, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Conservation+of+Synaptotagmin+(p65)+in+Drosophila+and+Humans.">Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans.</a> Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).</li><li>Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., S&#252;dhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exo-endocytotic+Recycling+of+Synaptic+Vesicles+in+Developing+Processes+of+Cultured+Hippocampal+Neurons.">Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons.</a> Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).</li><li>Ko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin-1+performs+neurexin-dependent+and+neurexin-independent+functions+in+synapse+validation.">Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation.</a> The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).</li><li>Shinoda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+enhances+spontaneous+and+activity-dependent+neurotransmitter+release+at+excitatory+terminals+but+not+at+inhibitory+terminals+in+hippocampal+neurons.">BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27 (2014).</li><li>Ivanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+controls+localization+and+function+of+CtBP+1+via+binding+to+Bassoon+and+Piccolo.">Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo.</a> The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).</li><li>Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+molecular+impairment+of+spontaneous+neurotransmission+modulates+synaptic+efficacy.">Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy.</a> Nature Communications. 8, 1-14 (2017).</li><li>Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kohlsch&#252;tter-T&#246;nz+syndrome+associated+gene+Rogdi+encodes+a+novel+presynaptic+protein.">The Kohlsch&#252;tter-T&#246;nz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rogdi+Defines+GABAergic+Control+of+a+Wake-promoting+Dopaminergic+Pathway+to+Sustain+Sleep+in+Drosophila.">Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila.</a> Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).</li><li>Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlsch&#252;tter, A., Zschocke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptic+encephalopathy+and+amelogenesis+imperfecta:+Kohlsch&#252;tter-T&#246;nz+syndrome.">Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlsch&#252;tter-T&#246;nz syndrome.</a> Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).</li><li>Kraszewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Vesicle+Dynamics+in+Living+Cultured+Hippocampal+Neurons+Visualized+with+CY3-Conjugated+Antibodies+Directed+against+the+Lumenal+Domain+of+Synaptotagmin.">Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin.</a> Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis.">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440, 935-939 (2006).</li><li>Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+mediate+presynaptic+maturation+through+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling.">Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> bioRxiv. , 262246 (2018).</li><li>Fuchs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(A)+receptors+can+initiate+the+formation+of+functional+inhibitory+GABAergic+synapses.">GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses.</a> European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).</li><li>Dresbach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regions+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+Bassoon:+Significance+for+synaptic+targeting+and+cytomatrix+anchoring.">Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+Prenatal+Mice.">Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).</li><li>Tsuriel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+sharing+as+a+predominant+determinant+of+synaptic+matrix+molecular+dynamics.">Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics.</a> PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).</li><li>Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+Synaptic+Vesicle+Recycling+Using+FM+Dyes+During+Evoked,+Spontaneous,+and+Miniature+Synaptic+Activities.">Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).</li><li>Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Synaptic+Vesicle+Endocytosis+in+Cultured+Hippocampal+Neurons.">Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).</li><li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+presynaptic+function.">Visualizing presynaptic function.</a> Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).</li><li>Opazo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+Intermixing+of+Synaptic+Vesicle+Components+upon+Vesicle+Recycling.">Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling.</a> Traffic. 11, 800-812 (2010).</li><li>Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+transduction+of+neuronal+cells.">Lentiviral transduction of neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).</li><li>Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexin+Clamps+Asynchronous+Release+by+Blocking+a+Secondary+Ca2++Sensor+via+Its+Accessory+&#945;+Helix.">Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory &#945; Helix.</a> Neuron. 68, 907-920 (2010).</li><li>Wittenmayer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+Neuroligin1+regulates+presynaptic+maturation.">Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).</li><li>Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Remodeling+of+the+Presynaptic+Cytomatrix+upon+Homeostatic+Adaptation+to+Network+Activity+Silencing.">Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing.</a> Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).</li><li>Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+synaptic+vesicles+in+nerve+endings+monitored+by+recovery+from+photobleaching+of+synaptic+vesicle-associated+fluorescence.">Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence.</a> Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).</li><li>Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+origin+of+synaptic+vesicles+undergoing+evoked+and+spontaneous+fusion.">A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion.</a> Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).</li><li>Han, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycosylation+Is+Essential+for+Vesicular+Targeting+of+Synaptotagmin+1.">N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1.</a> Neuron. 41, 85-99 (2004).</li><li>Kwon, S. E., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+is+dispensable+for+sorting+of+synaptotagmin+1+but+is+critical+for+targeting+of+SV2+and+synaptophysin+to+recycling+synaptic+vesicles.">Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).</li><li>Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pool-specific+modification+of+neurotransmitter+release+by+intravesicular+free+radical+generation.">Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation.</a> The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).</li><li>Sara, Y., Virmani, T., De&#225;k, F., Liu, X., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isolated+pool+of+vesicles+recycles+at+rest+and+drives+spontaneous+neurotransmission.">An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission.</a> Neuron. 45, 563-573 (2005).</li><li>Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+same+synaptic+vesicles+drive+active+and+spontaneous+release.">The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release.</a> Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).</li><li>Bacci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+blockade+of+glutamate+receptors+enhances+presynaptic+release+and+downregulates+the+interaction+between+synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated+membrane+protein+2.">Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2.</a> Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).</li><li>Piccoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+Controls+Synaptic+Vesicle+Storage+and+Mobilization+within+the+Recycling+Pool.">LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool.</a> Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).</li><li>Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+knockdown+of+AMPA+receptors+reveals+a+trans-synaptic+signal+for+presynaptic+maturation.">Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation.</a> The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).</li><li>Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing+synaptic+vesicles+are+inactivated+by+contamination+with+SNAP25.">Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25.</a> bioRxiv. , 172239 (2017).</li></ol>

ישנם שלושה מבחני בשימוש שגרתי ללמוד שלפוחית סינפטית (SV) מיחזור. השניים הראשונים כוללים את השימוש) styryl פלורסנט צבענים כמו FM1-43 (אשר לשלב ממברנות נלקחים לתוך organelles במהלך אנדוציטוזה, משתחררים לאחר אקסוציטוזה); ו- b) fluorescently מתויג חומרים SV (אשר, על ביטוי, לשלב מכונות מיחזור proteinaceous). אם fluorophores מצורף...

לומד שלפוחית סינפטית מיחזור חשוב בקביעת כיצד לשנות מאפיינים presynaptic, במהלך הפלסטיות הסינפטית או בתגובה ההפרעות בתפקוד סינפטית. נוגדן ספיגת לומד Synaptotagmin-1 (Syt1) מספק שיטה אחת של מד-SV מיחזור. Syt1 הוא חלבון SV-הקשורים משמש חיישן2 + Ca, הוא הכרחי עבור שחרור exocytotic של הנוירוטרנסמיטר1,2. . זה חלבון טראנסממברנלי עם תחום cytoplasmic C-מסוף מחוץ ה-SV, תחום luminal של N-מסוף בתוך SV3... במהלך אקסוציטוזה, תחום luminal של Syt1 הופך להיות חשוף למדיום החיצוני. למדיום החיצוני זה, אנו מוסיפים נוגדנים נגד קבוצת המחשבים cytoplasmic, אשר הופך הפנימו במהלך אנדוציטוזה. נוגדנים אלו יכולים להיות שגם מראש מצומדת עם fluorophores או immunostained עם נוגדנים משניים4,5,6,7. עוצמת קרינה פלואורסצנטית immunosignal שנוצר הוא יחסי לסכום של SV מיחזור. גישה זו יכול לשמש כדי לקבוע SV מכוננת והן דפולריזציה-induced מיחזור6,8.
מבחני ספיגת Syt1 יכול להתבצע לאחר העברה גנטית וירוס בתיווך על כמעט כל התאים בצלחת או לאחר תרביות תאים דליל של מספר קטן של תאים. השיטה שלנו משלב וזמינותו עם תרביות תאים זוגיים דלילה של נוירונים בהיפוקמפוס העיקרי באמצעות סידן פוספט9. אנו משתמשים חלבון רקומביננטי סמן ידוע לצבור ב presynapses, Synaptophysin fluorescently מתויגות, לאיתור מסופי presynaptic של overexpress שלנו חלבון של עניין, Rogdi. זה מאפשר לנו לבדוק אם לאו Rogdi מטרות פונקציונלי synapses ומשפיע SV מיחזור. הגן קידוד Rogdi זוהה במקור ב מסך למוטאנטים דרוזופילה מאופיין זיכרון לקוי10. בבני אדם, מוטציות בגן Rogdi לגרום מחלה נדירה ולא הרסניות הנקראת תסמונת Kohlschütter-Tönz. חולים הסובלים אמייל השיניים מומים pharmacoresistant אפילפסיה, העיכובים psychomotor; עם זאת, ההתאמה subcellular של המוצר הגן נשאר חמקמק11. לפיכך, וזמינותו ספיגת Syt1 סיפק ראיות מפתח עבור ההתאמה של GFP מתויג Rogdi הסינפסות פונקציונלי9.
טכניקה זו ספיגת יש מספר יתרונות. ראשית, SV מיחזור יכול להיות שנצפו הן בזמן אמת על ידי ביצוע חי7,הדמיה12, ואחרי קיבוע6,9 על ידי מדידת עוצמת קרינה פלואורסצנטית של התווית זריחה Syt1. בנוסף, פותחו גרסאות שונות של נוגדן Syt1. ישנם גרסאות לא מתויגות ניתן שכותרתו עם נוגדנים משניים בעקבות פרוטוקול סטנדרטי immunostaining לאחר קיבוע, וכל הווריאנטים מצומדת מראש עם תווית פלורסצנטיות כבר מצורף. לבסוף, זריחה נוגדן מבוססי היא יתרון בשל מבחר עשיר של צבעים משניים או מצומדת זמינים מסחרית שניתן להשתמש בהם.
כאשר תיקון ו immunostaining הנוירונים, זה גם אפשרי כתם חלבונים נוספים ולבצע ניתוח colocalization. זה יכול לעזור לקבוע היכן הם ממוקמים ביחס SVs מיחזור. האינטנסיביות של התווית פלורסצנטיות היא מדד ישיר של כמות SV מיחזור. בנוסף, הנוגדנים באופן סלקטיבי תווית מבנים המכילים Syt1, וכתוצאה מכך ירידה לפרטים גבוה מעט רקע זריחה4. פרוטוקולים גירוי שונות יכולות לשמש, כגון מאגרי דפולריזציה או גירוי חשמלי פרוטוקולים9,12,13,14. עם זאת, מיחזור SV הבזליים ניתן למדוד ללא גירוי של תרבויות עצביים15.
השיטה שלנו מטפל באופן ספציפי Syt1 ספיגת נוגדן בנוירונים transfected כפול עם נוגדן משני immunolabeling לאחר קיבוע. עם זאת, אנו מתייחסים כל הווריאציות בשימוש שגרתי של וזמינותו בדיון שלנו לתת לצופים הזדמנות להתאים הפרוטוקול לצרכים הספציפיים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.03456.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti mouse Alexa 647</td>
			<td>Jackson-Immunoresearch</td>
			<td>715605151</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiwell 24 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>087721H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube (50 mL)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>BiochromAG</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,083,421,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell 150 (Inkubator)</td>
			<td colspan="2">ThermoElectron Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>M0250-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10144633CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol4-88</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1394KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>5155KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenView Experiment Analysis Application</td>
			<td>Free software, see comments</td>
			<td></td>
			<td>written by Noam E. Ziv, Technion &#8211; Israel Institute of Technology, Haifa, Israel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penstrep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>safety hood</td>
			<td>ThermoElectron</td>
			<td></td>
			<td>Serial No. 40649111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>neoFroxx</td>
			<td>1104kg001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptotagmin1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>105311</td>
			<td>mouse monoclonal; clone 604.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,086,031,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genius 3&#160;</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3340001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Observer. Z1&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optical assay for synaptic vesicle recycling in cultured neurons overexpressing presynaptic proteins

ב- active presynaptic קצות עצבים היקפיים, הסינפטיות עוברים מחזורים של מסכות, אנדוציטוזה. במהלך מיחזור, התחומים luminal של חלבונים transmembrane SV הופכים חשופים על פני התא. אחד החלבונים האלה הוא Synaptotagmin-1 (Syt1). נוגדן נגד תחום luminal של Syt1, פעם נוספו המדיום תרבות, הוא נלקח במהלך מחזור exo-endocytotic. זו תפיסה פרופורציונלית לכמות SV מיחזור, ניתן לכמת דרך immunofluorescence. כאן, אנו משלבים את ספיגת נוגדן Syt1 עם תרביות תאים כפול של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית. זה מאפשר לנו (1) בתרגום אתרי presynaptic המבוססים על ביטוי של סמן רקומביננטי presynaptic Synaptophysin, (2) לקבוע את הפונקציונליות שלהם באמצעות ספיגת Syt1 ו- (3) לאפיין את המיקוד ואת ההשפעות של חלבון של עניין, GFP-Rogdi.

תוצאה צפויה של גישה זו היא איתור כ 50 transfected כפול נוירונים לכל coverslip ב צפיפות של נוירונים 50,000 לכל טוב. הפעולה באקסון של הנוירון כל צפוי להראות נקודות חמות מרובות של מתויג fluorescently הצטברות Synaptophysin, ומציין אשכולות ofSVs. באתרים presynaptic תפקודית, האות Synaptophysin רקומביננטי colocalizes עם זריח...

Watch this Scientific Journal Video about An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins at JoVE.com

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

אנו מתארים של assay אופטי עבור שלפוחית סינפטית (SV) מיחזור בנוירונים בתרבית. שילוב פרוטוקול זה עם תרביות תאים כפול לבטא סמן presynaptic וחלבון עניין מאפשר לנו לאתר אתרי presynaptic, שלהם שלפוחית סינפטית מיחזור קיבולת, ולקבוע את תפקידו של החלבון עניין.

וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

לימוד בריכות שלפוחיות Synaptic באמצעות photoconversion של צבעים Styryl

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) של החלבונים המתויגים הקרינה הקוצים הדנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

ניתוח של מורפולוגיה השדרה דנדריטים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית Cultured

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

בחינה של Synaptic שלפוחיות מחזור באמצעות צבעי FM במהלך עורר, ספונטני, ופעילויות Synaptic מיניאטורות

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...