Name: an optical assay for synaptic vesicle recycling in cultured neurons overexpressing presynaptic proteins
Uploaded: 2018-06-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins at JoVE.com

우리는 전문가 기술 지원을 위한 Irmgard와 이즈를 감사합니다. 이 작품은 나노미터 범위에 현미경 검사 법에 대 한 우수성의 클러스터 (CNMPB, b 1-7, T.D.) 뇌의 분자 생리학을 통해 DFG에 의해 지원 되었다.

아니 살아있는 동물 연구를 실시 했다. 안락사 동물 세포 문화 승인 아래 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin 괴팅겐) 현지 동물 보호 당국에 의해 승인 되었다를 포함 하는 실험 번호 T10/30. 실험 승인 프로토콜 실시 했다.
1. 기본 Hippocampal 세포 배양
<ol><li>배아 하루 1916,17에 쥐 해 마의 천연된 세포 배양을 준비 합니다. 12 m m coverslips...

<ol>
	<li>Koh, T., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin+I,+a+Ca2++sensor+for+neurotransmitter+release.">Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release.</a> Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).</li><li>Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Does+Synaptotagmin+Trigger+Neurotransmitter+Release.">How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release.</a> Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).</li><li>Perin, M. 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E., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+is+dispensable+for+sorting+of+synaptotagmin+1+but+is+critical+for+targeting+of+SV2+and+synaptophysin+to+recycling+synaptic+vesicles.">Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).</li><li>Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. 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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+same+synaptic+vesicles+drive+active+and+spontaneous+release.">The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release.</a> Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).</li><li>Bacci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+blockade+of+glutamate+receptors+enhances+presynaptic+release+and+downregulates+the+interaction+between+synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated+membrane+protein+2.">Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2.</a> Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).</li><li>Piccoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+Controls+Synaptic+Vesicle+Storage+and+Mobilization+within+the+Recycling+Pool.">LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool.</a> Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).</li><li>Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+knockdown+of+AMPA+receptors+reveals+a+trans-synaptic+signal+for+presynaptic+maturation.">Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation.</a> The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).</li><li>Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing+synaptic+vesicles+are+inactivated+by+contamination+with+SNAP25.">Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25.</a> bioRxiv. , 172239 (2017).</li></ol>

정기적으로 재활용 시 냅 스 소포 (SV)를 공부 하는 데 사용 하는 3 개의 분석을 확인 하 고 있습니다. 처음 두의 사용을 포함 한) 형광 styryl FM1-43 (이 막에 통합 하 고 세포로 endocytosis, 동안 채택 exocytosis 후 해제 됩니다); 같은 염료 그리고 b) 붙일 재조합 SV 단백질 (, overexpression, 따라 배치할 재활용 기계에 통합) 태그. 연결 된 fluorophores 그들의 형광은 pH에 따라 변경는 SV의 산 성 내부와 extracellular 매?...

연 접 속성 변경, 시 냅 스가 소성 또는 시 냅 스 기능의 섭 동에 대응에서 하는 방법 시 냅 스 소포 재활용 공부 하는 것은 결정에 중요 하다. Synaptotagmin-1 (Syt1) 공부 항 체 이해는 SV 재활용의 양을 측정 한 방법을 제공 합니다. Syt1 Ca2 + 센서 역할을 신경 전달 물질1,2의 exocytotic 출시에 필요한 SV 관련 된 단백질 이다. 그것은 SV 외부 단자 세포질 도메인와 SV3내부 N 맨끝 luminal 도메인 막 횡단 단백질. Exocytosis, 동안 Syt1 luminal 도메인 외부 매체에 노출 된다. 이 외부 매체에 우리 endocytosis 동안 내 면 된다 세포질 도메인에 대하여 지시 하는 항 체를 추가 합니다. 이러한 항 체 중 미리 fluorophores 또는 이차 항 체4,,56,7immunostained와 함께 활용 될 수 있습니다. 결과 immunosignal의 형광 강도 SV 재활용의 양에 비례 합니다. 이 방법은6,8재활용 제정 및 도발은 유도 SV를 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.
접시에 거의 모든 세포에 바이러스 중재 하는 유전자 이동 또는 세포의 작은 숫자의 스파스 transfection Syt1 이해 분석 실험을 수행할 수 있습니다. 우리의 방법은 칼슘 인산 염9를 사용 하 여 기본 hippocampal 신경의 스파스 더블 transfection 분석 결과 결합 합니다. 재조합 마커 단백질 presynapses에서 축적 하는 것으로 알려져 붙일 태그 Synaptophysin, 연 접 맨끝을 찾아서 우리의 단백질, Rogdi의 overexpress를 사용 합니다. 수 있습니다 테스트 여부 Rogdi 기능 synapses 대상과 SV 재활용에 영향을 줍니다. Rogdi 인코딩 유전자 초파리 돌연변이 장애인된 메모리10특징에 대 한 화면에서 원래 확인 되었다. 인간에서는, Rogdi 유전자에 있는 돌연변이 Kohlschütter Tönz 증후군 이라는 희귀 하 고 치명적인 질병을 일으킬. 치과 나 멜 기형, pharmacoresistant 간 질 및 정신 운동 지연;에서 고통 받는 환자 그러나, 유전자 제품의 subcellular 지 방화 하기 어려운11남아 있었다. 따라서, Syt1 이해 분석 결과 제공 기능 시 냅 스9에서 GFP 태그 Rogdi의 지역화에 대 한 주요 증거.
이 통풍 관 기술에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, SV 재활용 관찰할 수 있습니다 모두 실시간으로 라이브 이미징7,12, 수행 하 여 및 고정6,9 후 Syt1 형광 라벨의 형광 강도 측정 하 여. 또한, 여러 Syt1 항 체 변종 개발 되었습니다. 다음 표준 immunostaining 프로토콜, 고정 후 2 차 항 체로 표시 될 수 있습니다 태그 변종 그리고 이미 연결 된 형광 라벨와 사전 활용된 이체 있다. 마지막으로, 형광 항 체 기반으로 사용할 수 있는 상용 보조 또는 활용 된 염료의 큰 선택 때문에 유리 하다.
때 고정 하 고 immunostaining 신경, 그것은 또한 추가적인 단백질을 위한 얼룩 colocalization 분석을 수행 하. 이 그들이 있는 재활용 SVs에 관하여 결정을 도울 수 있다. 형광 라벨의 강도 SV 재활용의 양 직접 측정. 또한, 항 체는 선택적으로 포함 하는 Syt1 구조, 높은 특이성 및 작은 배경 형광4결과로 라벨. 다른 자극 프로토콜 또한 사용할 수 있습니다, 같은 도발은 버퍼 또는 전기 자극 프로토콜9,12,,1314. 그러나, 기초 SV 재활용 신경 문화15자극 없이 측정할 수 있습니다.
우리의 방법은 구체적으로 고정 후 이차 항 체 immunolabeling와 더블 페 뉴런에서 Syt1 항 체 이해를 해결합니다. 그러나, 우리는 시청자에 게 프로토콜 특정 요구에 적응 하는 기회를 우리의 논의에 분석 결과의 모든 일상적으로 사용 된 이체를 참조 하십시오.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.03456.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti mouse Alexa 647</td>
			<td>Jackson-Immunoresearch</td>
			<td>715605151</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiwell 24 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>087721H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube (50 mL)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>BiochromAG</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,083,421,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell 150 (Inkubator)</td>
			<td colspan="2">ThermoElectron Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>M0250-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10144633CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol4-88</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1394KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>5155KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenView Experiment Analysis Application</td>
			<td>Free software, see comments</td>
			<td></td>
			<td>written by Noam E. Ziv, Technion &#8211; Israel Institute of Technology, Haifa, Israel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penstrep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>safety hood</td>
			<td>ThermoElectron</td>
			<td></td>
			<td>Serial No. 40649111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>neoFroxx</td>
			<td>1104kg001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptotagmin1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>105311</td>
			<td>mouse monoclonal; clone 604.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,086,031,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genius 3&#160;</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3340001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Observer. Z1&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optical assay for synaptic vesicle recycling in cultured neurons overexpressing presynaptic proteins

활성 연 접 신경 맨끝에서 시 냅 스 소포 주기를 및 endocytosis를 받 다. 재활용, 하는 동안 SV 막 횡단 단백질의 luminal 도메인 세포 표면에 노출 된다. 이러한 단백질 중 Synaptotagmin-1 (Syt1) 이다. 항 체를 한 번 문화 매체에 추가 하는 Syt1 luminal 도메인에 대 한 감독 엑 소 endocytotic 주기 동안 가져온 것입니다. 이 글귀 SV 재활용의 금액에 비례 하 고 면역 형광을 통해 정해질 수 있다. 여기, 우리가 교양된 hippocampal 신경의 이중 transfection Syt1 항 체 통풍 관 결합. (1) 연 접 사이트 재조합 연 접 마커 Synaptophysin의 식에 따라 지역화, (2) 결정 Syt1 통풍 관을 사용 하 여 그들의 기능 및 (3) 특성화 고 대상으로 우리와 관심, GFP Rogdi 단백질의 효과 수 있습니다.

이 접근의 예상된 결과 잘 당 50000 뉴런의 밀도에 coverslip 당 약 50 더블 페 뉴런 찾는 것입니다. 각 신경의 축 삭 붙일 태그 Synaptophysin 축적, 나타내는 클러스터 ofSVs의 여러 핫스팟 표시 예정 이다. 기능적 연 접 사이트에서 재조합 Synaptophysin 신호 punctate Syt1 형광으로 colocalizes. 더블 transfection를 사용 하 여, 관심 (그림 1)의 단백질으로 GFP-Rogdi 또는 mGFP 제...

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An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

우리는 교양된 뉴런에 재활용 시 냅 스 소포 (SV)에 대 한 광학 분석 결과 설명 합니다. 더블 transfection는 연 접 마커 관심사의 단백질을 표현 하는이 프로토콜을 결합 연 접 사이트를 그들의 시 냅 스 소포 용량, 재활용 찾아서 관심사의 단백질의 역할을 결정할 수 있습니다.

시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Styryl 염료의 Photoconversion를 사용하여 시냅틱 소포 풀 유학

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

연구

신경과학

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

교양 공감 뉴런의 돌기 성장을 유도

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...