Name: intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model
Uploaded: 2018-10-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model at JoVE.com

De eksperimentelle protokoller blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg på The children's Hospital of Philadelphia.
1. oprettelse af injektion pipetter
<ol><li>Ved hjælp af en lodret mikropipette puller, trække en 100 µL microcapillary pipette (figur 1A - 1 C). Kalibrere mikropipette puller, således at den tilspidsede ende er > 1 cm lange. Bemærk: I første omgang, indstillingerne for puller bør justeres for en o...

<ol>
	<li>Loukogeorgakis, S., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+stem+cell+and+gene+therapy:+current+status+and+future+perspectives.">In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives.</a> European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).</li><li>Vrecenak, J., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+hematopoietic+cell+transplantation:+recent+progress+and+the+potential+for+clinical+application.">In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application.</a> Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+murine+hemoglobinopathies+by+prenatal+tolerance+induction+and+postnatal+nonmyeloablative+allogeneic+BM+transplants.">Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants.</a> Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).</li><li>Vrecenak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Long-Term+Mixed+Chimerism+Achieved+in+a+Canine+Model+of+Allogeneic+in+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD26+Inhibition+Enhances+Allogeneic+Donor-Cell+Homing+and+Engraftment+after+in+utero+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).</li><li>Waddington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+gene+transfer+of+human+factor+IX+to+fetal+mice+can+induce+postnatal+tolerance+of+the+exogenous+clotting+factor.">In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor.</a> Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).</li><li>Stitelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Stage+Determines+Efficiency+of+Gene+Transfer+to+Muscle+Satellite+Cells+by+in+utero+Delivery+of+Adeno-Associated+Virus+Vector+Serotype+2/9.">Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 1, 14040 (2014).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Transfer+to+Ocular+Stem+Cells+by+Early+Gestational+Intraamniotic+Injection+of+Lentiviral+Vector.">Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector.</a> Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).</li><li>Boelig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intravenous+Route+of+Injection+Optimizes+Engraftment+and+Survival+in+the+Murine+Model+of+In+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-amniotic+Transient+Transduction+of+the+Periderm+with+a+Viral+Vector+Encoding+TGF&#946;3+Prevents+Cleft+Palate+in+Tgf&#946;3-/-.+Mouse+Embryos.">Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGF&#946;3 Prevents Cleft Palate in Tgf&#946;3-/-. Mouse Embryos.</a> Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).</li><li>Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+gestational+gene+transfer+of+IL-10+by+systemic+administration+of+lentiviral+vector+can+prevent+arthritis+in+a+murine+model.">Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model.</a> Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).</li><li>Reay, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-Length+Dystrophin+Gene+Transfer+to+the+Mdx+Mouse+in+utero.">Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero.</a> Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).</li><li>Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Mor&#225;n, M., Y&#225;&#241;ez-Mu&#241;oz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Transduction+of+Spinal+Cord+Motor+Neurons+by+Intrauterine+Delivery+of+Integration-Deficient+Lentiviral+Vectors.">High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors.</a> Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).</li><li>Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Brain-Directed+AAV+Gene+Therapy+Results+in+Rapid,+Robust,+and+Persistent+Transduction+of+Mouse+Choroid+Plexus+Epithelia.">Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).</li><li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+in+utero+transplantation.">A mouse model of in utero transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).</li><li>Davey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaagsiekte+Sheep+Retrovirus+Pseudotyped+Lentiviral+Vector-Mediated+Gene+Transfer+to+Fetal+Ovine+Lung.">Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung.</a> Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).</li></ol>

In utero transplantation er en potentiel terapi for mange medfødte lidelser, der kan blive diagnosticeret tidligt i drægtigheden. Den murine model for IUT'EN giver forskere til at udforske den føtale miljø eller at eksperimentere med forskellige behandlingsformer. Afhængigt af hvad sprøjtes og hvad er at være målrettet, kan intravenøs eller intra-fostervand i utero transplantation give en pålidelig levering af en injectant til den ønskede plads.
Når du målretter ...

De seneste fremskridt i prænatal screening og diagnose har kastet lys over muligheden for behandling af fosteret for en række medfødte lidelser, som ikke har tilstrækkelig postnatal behandlingsmuligheder og resultere i betydelig sygelighed og dødelighed. Specifikt, har i utero hæmatopoietisk stamcelletransplantation (IUHCT) og gen terapi/genom-redigering potentiale til at drage fordel af normale udviklingsmæssige egenskaber af fosteret til behandling af medfødt hæmatologiske, immun og genetiske sygdomme mere effektivt end postnatal HSC transplantation og gen terapi/genom-redigering kan gøre1,2. Specifikt, på grund af den lille størrelse af fosteret, kan donor celle eller viral vektor dosis være maksimeret pr. vægten af modtageren. Derudover tillader de immunologiske umodenhed af fosteret donor HSCs sprøjtes uden myeloablative og immunosuppressive konditionering, der kræves i postnatal transplantation protokoller. På samme måde, virale vektorer transporterer en terapeutisk transgen eller genom-redigering teknologi kan sprøjtes uden en begrænsende immunrespons til enten transgen produkt eller den virale vektor. Endelig, tilgængelighed og proliferativ karakter af føtal stem/stamceller råd til muligheden for en mere effektiv transduktion af målcellerne inspirator, samt visse former for genom redigering (homologi-instrueret reparation), som kræver cykling celler at forekomme effektivt. Den murine model fungerer som en indsigtsfuld og overkommelige midler til at tage fat på vigtige spørgsmål i stilken cellebiologi og Immunologi før eksperimenterer i prækliniske store dyremodeller og som sådan har fungeret som den primære model, hvor IUHCT og i livmoderen genterapi har været udforsket1,2,3.
Selv om mange variabler spiller en vigtig rolle for succesen af IUHCT og i utero gen terapi/genom-redigering i murine og store dyremodeller, er en central variabel metode til levering af HSCs eller viral vektor. Levering af store doser af donor HSCs med en first-pass virkning vil indtræffe i føtal leveren, hæmatopoietisk orgel på tidspunktet for IUHCT, har vist sig at være medvirkende til at nå macrochimeric niveauer af engraftment i mus og store dyremodeller4 ,5. Dette blev opnået via en indsprøjtning af donor celler via den vitelline vene i musemodel og via en intra hjerte indsprøjtning i den canine model. Ruten af injektion spiller også en afgørende rolle i at målrette stamceller af forskellige organer under udvikling. For eksempel, en intravenøs injektion via vitelline venen har vist sig at effektivt transduce cardiomyocytes og hepatocytter efter en sen drægtighed injektion6,7. Alternativt, en intra-fostervand indsprøjtning af virale vektorer giver mulighed for målretning af organer, der er fysisk udsat baseret på embryonale foldning/udvikling på tidspunktet for indsprøjtning8. Dette er bedst eksemplificeret ved målretning af respiratoriske epitel via en intra-fostervand indsprøjtning sent i drægtigheden at drage fordel af normale føtal "vejrtrækning" bevægelser, som udsætter luftveje til den virale vektor i den fostervand flydende9. Disse to tilstande på IUT'EN, intravenøs via vitelline venen og intra-fostervand, har været grundlaget for flere tidligere og igangværende forsøg i vores laboratorium. I denne protokol beskriver vi i detaljer metoderne for at udføre intravenøs og intra-fostervand IUT'EN i modellens murine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Gloves</td>
			<td style="width:168px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:147px;">2D73DP65</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/ teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/o teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14075-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heavy Scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14002-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Needle Driver</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">12005-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vicryl 2.0</td>
			<td style="width:168px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">JB945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Transfer Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">GSI135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">MDS202000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">50 mL Conical tube</td>
			<td style="width:168px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Tape</td>
			<td style="width:168px;">3M</td>
			<td style="width:147px;">1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Eye lubricant</td>
			<td style="width:168px;">Major LubriFresh</td>
			<td style="width:147px;">0904-6488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:168px;">K&#38;H</td>
			<td style="width:147px;">3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:168px;">Leica</td>
			<td style="width:147px;">MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Injector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">HI01PK01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Glass Capillary tubes</td>
			<td style="width:168px;">Kimble</td>
			<td style="width:147px;">71900-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vertical Micropipette Puller</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Microelectrode Beveler</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">IM-300 Pneumatic Microinjector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">IM-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Insulin Syringe&#160;</td>
			<td style="width:168px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:147px;">305935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Filter</td>
			<td style="width:168px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:147px;">25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Compac5 Anesthesia Machine</td>
			<td style="width:168px;">VetEquip Compac5</td>
			<td style="width:147px;">901812&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:168px;">Piramal Critical Care</td>
			<td style="width:147px;">NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">N2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">NI 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">O2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">OX 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Ad-GFP viral vector</td>
			<td style="width:168px;">Penn Vector Core</td>
			<td style="width:147px;">H5&#39;.040.CMV.eGFP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model

In utero transplantation (IUT'EN) er en unik og alsidig tilstand af terapi, der kan bruges til at indføre stamceller, virale vektorer eller andre stoffer i begyndelsen af drægtighedsperioden. Rationalet bag IUT'EN til terapeutiske formål er baseret på den lille størrelse af fosteret, den føtale immunologiske umodenhed, tilgængelighed og proliferativ karakter af de føtale stamceller eller stamfader celler, og potentiale til at behandle en sygdom eller symptomdebut forud for fødslen. At drage fordel af disse normale udviklingsmæssige egenskaber af fosteret, levering af hæmatopoietisk stamceller (HSC) via en IUT'EN har potentiale til behandling af medfødt hæmatologiske lidelser såsom seglcelleanæmi, uden de nødvendige myeloablative eller immunsupprimerende conditioning kræves for postnatal HSC transplantationer. På samme måde, tilgængelighed af stamceller i flere organer under udvikling potentielt giver mulighed for en mere effektiv målretning af stem/stamceller efter en IUT'EN af virale vektorer for genterapi eller genom-redigering. Derudover kan IUT'EN blive brugt til at studere normale udviklingsprocesser, herunder, men ikke begrænset til, udvikling af immunologisk tolerance. Den murine model giver en værdifuld og overkommelige midler til at forstå de muligheder og begrænsninger på IUT'EN før prækliniske store dyreforsøg og en eventuel klinisk anvendelse. Her, beskriver vi en protokol for at udføre en IUT'EN i murine fosteret gennem intravenøs og intra-fostervand ruter. Denne protokol har været anvendt med succes til at belyse de nødvendige betingelser og mekanismer bag i utero hæmatopoietisk stamcelletransplantation, tolerance induktion og i utero genterapi.

Overlevelse og engraftment er vigtige foranstaltninger af succes for IUHCT eksperimenter. Afhængigt af de specifikke endpoints af et eksperiment, kan fostre, der modtog en IUHCT analyseres prænatalt ved en c-sektion eller efter fødslen. I gennemsnit spænder overlevelsesrate efter intravenøse injektioner fra 75-100%. Overlevelsesraten efter intra-fostervand injektioner tendens til at fair bedre end intravenøse injektioner, på omkring 85-100%.
<p class="jove_content" fo:keep-toge...

Watch this Scientific Journal Video about Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model at JoVE.com

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenøs og Intra-fostervand In Utero Transplantation i Murine Model

Vi beskriver en protokol til at udføre en i utero transplantation (IUT'EN) gennem intravenøs og intra-fostervand ruter af injektion i murine model. Denne protokol kan bruges til at indføre celler, virale vektorer og andre stoffer i den unikke immun-tolerant føtal miljø.

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i embryologi, genterapi og stamcelletransplantation. En fordel ved denne teknik er, at det muliggør analyse af virkningerne af forskellige eksperimentelle behandlingsformer på Murine fostre. Demonstrere denne procedure vil være læger Nicholas Ahn, og Barbara Coons, læger og forskningsstipendiater i vores laboratorium.Før proceduren påbegyndes, skal du slippe fem til 10 mikroliter steril PBS ind og ud af den kirurgiske nålespids, to til tre gange for at fjerne det af eventuelle snavs. Næste fylde nålen med reagens af interesse på passende eksperimentel volumen og koncentration. Og tryk tre gange på modeknappen på mikroinjektoren for at gå videre til injektionskalibreringsskærmen.Tilføj intervaller på 10 eller 100 millisekunder for at justere injektionstiden, og tryk på tilstandsknappen to gange mere. Tryk på balanceknappen, og tryk én gang på fodpedalen. Tryk derefter på pedalen igen, og vurder, hvilket opløsningsvolumen der tømmes ud af nålen pr. tryk.Når mikroinjektoren er kalibreret til det relevante eksperimentelle volumen, skal nålen fyldes til det korrekte niveau for injektionen. Når alle nåle er blevet renset, bekræfte en manglende reaktion på tå knivspids af den gravide to til seks måneder gamle kvindelige mus. Barber maven, passe på ikke at beskadige brystvorterne, og overføre dyret til en varmepude i liggende position.Påfør salve til dyrets øjne og fastgør lemmerne på varmepuden med tape. Og desinficere den eksponerede hud. Derefter injicere lokalbedøvelse såsom 100 mikroliter af 0,25% Bupivacain subkutant.Dernæst gør en en til to centimeter hud indsnit sådan, at den nederste grænse ikke er tættere end en centimeter til introitus, og identificere midterlinjen af fascia, passe på ikke at skade de omkringliggende epigastriske fartøjer. Brug Adson scener, knibe fascia uden at snuppe nogen af de underliggende organer eller fostre, og åbne vævet med en saks. Når sikkert i bughulen, udvide fascial snit til længden af huden indsnit, og bruge bomuld spids applikatorer til at flytte tarmene ind i den øverste del af maven for at udsætte gravid livmoderen.Uddrag livmoderen gennem snittet omhyggeligt at identificere højre og venstre æggestokke for at sikre, at alle fostre tælles. Placer den venstre livmoder tilbage i maven, så kun den højre livmoder er udsat, for at holde de ikke injicerede fostre varme. Og forsigtigt gribe på den mest laterale fostervandssæk mellem tommel-og pegefingre af den ikke dominerende hånd.Placer dissektion mikroskop over dyret og justere fokus og belysning for en bedre visualisering af fosteret efter behov. For en intravenøs injektion rotere livmoderen, således at vitelline forgæves, der skal injiceres, er parallel med nålen spidsen. Og læg nålen på livmoderen i en fem graders vinkel for at gennembore livmodervæggen.Med spidsen mellem livmodervæggen og fostervandssækken skal du placere spidsen direkte oven på vitellinen forfængelig og i en næsten tangentiel vinkel, glide nålen over forgæves, indtil facetet rykker ind i fartøjet. Det er bydende nødvendigt, at vinklen forbliver lav, så nålen ikke trænger ind i bagvæggen af fartøjet. Når der observeres en plet af blod på nålespidsen, skal du trykke på fodpedalen for at indsprøjte hele mængden af materiale af interesse i beholderen.Ved intra fostervandsindsprøjtning skal fostervandssækken roteres, indtil der er fundet et sted uden fartøjer. Peg nålen vinkelret på livmodervæggen og gennembor nålen gennem livmoderen æggeblomme sæk, og fostervandssækken pas på ikke trænge ind i nogen føtal væv. Derefter injiceres den ønskede mængde materiale.Efter begge typer injektion trækkes nålen ud af injektionsstedet, når det ønskede volumen er leveret. Og fortsæt til det næste foster, indtil alle fostre af højre livmoder horn er blevet injiceret. Derefter returnere den rigtige livmoder horn ind i maven.Og fjern venstre livmoderhorn ud af maven. Når alle fostre i venstre horn er blevet injiceret returnere hele livmoderen til maven, idet man skal passe på at undgå en livmoder eller intestinal volvulus. Brug en engangstransferpipette til at dispensere omkring to milliliter steril PBS ind i maven for at erstatte eventuelle ufølsome tab.Og brug 4-0 polyglactin 910 suturer til at lukke fascia og maven i et kontinuerligt lag. Overfør derefter musen til et rent bur under en varmelampe med overvågning, indtil fuld recumbency. I denne uddannelse eksperiment leverne af fostre, der modtog in-utero transplantation af en praktikant viste lavere fluorescerende niveauer 24 timer efter injektion, på grund af en lavere engraftment af de transplanterede GFP celler, end gjorde lever injiceres af en erfaren instruktør.Flow cytometrisk analyse for GFP positive donorceller også korreleret med det lavere niveau af lysstofrør observeret under fluorescerende mikroskopi. Muligheden for virale vektorer leveret via intra-fostervandsvejen til transduceceller i kontakt med fostervandet. Eksemplificeres ved transduktion af epitelceller 48 timer efter in utero injektion af Adeno-virus bærer GFP transgene i svangerskabsdag 12.5 fostre.Når mestrer denne teknik kan afsluttes i 15-25 minutter pr gravid mus. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man sikkert og effektivt levere forskellige behandlinger til mus fostre.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Rumlig og tidsmæssig analyse af Active ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; Kimcellelinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Kultur af murine embryonale Mellemfodsben: en fysiologisk model af endochondral ossifikation

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

En ny mammedisk fedtpudstransplantationsteknik til visualisering af fartøjsgenerering af vaskulære endotelceller

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anvendelse af RNAi og Heat-shock-induceret transskription faktor udtryk til at omprogrammere kønsceller til neuroner i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celle sammenlægning Assays til at evaluere bindingen af Drosophila Notch med Trans-ligander og dens hæmning af Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-medieret tab af funktion analyse i cerebellare granula celler ved hjælp af In Utero elektroporation-baseret overførsel af gener

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...