Name: intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model
Uploaded: 2018-10-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model at JoVE.com

De experimentele protocollen werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij The Children's Hospital of Philadelphia.
1. verwezenlijking van injectie pipetten
<ol><li>Met behulp van een verticale micropipet trekker, trek Pipetteer 100 µL microcapillary (figuur 1A - 1 C). Kalibreer de trekker van de micropipet zodat de taps toelopende einde > 1 cm lang. Opmerking: In eerste instantie, de instellingen van de trekk...

<ol>
	<li>Loukogeorgakis, S., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+stem+cell+and+gene+therapy:+current+status+and+future+perspectives.">In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives.</a> European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).</li><li>Vrecenak, J., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+hematopoietic+cell+transplantation:+recent+progress+and+the+potential+for+clinical+application.">In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application.</a> Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+murine+hemoglobinopathies+by+prenatal+tolerance+induction+and+postnatal+nonmyeloablative+allogeneic+BM+transplants.">Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants.</a> Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).</li><li>Vrecenak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Long-Term+Mixed+Chimerism+Achieved+in+a+Canine+Model+of+Allogeneic+in+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD26+Inhibition+Enhances+Allogeneic+Donor-Cell+Homing+and+Engraftment+after+in+utero+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).</li><li>Waddington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+gene+transfer+of+human+factor+IX+to+fetal+mice+can+induce+postnatal+tolerance+of+the+exogenous+clotting+factor.">In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor.</a> Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).</li><li>Stitelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Stage+Determines+Efficiency+of+Gene+Transfer+to+Muscle+Satellite+Cells+by+in+utero+Delivery+of+Adeno-Associated+Virus+Vector+Serotype+2/9.">Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 1, 14040 (2014).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Transfer+to+Ocular+Stem+Cells+by+Early+Gestational+Intraamniotic+Injection+of+Lentiviral+Vector.">Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector.</a> Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).</li><li>Boelig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intravenous+Route+of+Injection+Optimizes+Engraftment+and+Survival+in+the+Murine+Model+of+In+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-amniotic+Transient+Transduction+of+the+Periderm+with+a+Viral+Vector+Encoding+TGF&#946;3+Prevents+Cleft+Palate+in+Tgf&#946;3-/-.+Mouse+Embryos.">Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGF&#946;3 Prevents Cleft Palate in Tgf&#946;3-/-. Mouse Embryos.</a> Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).</li><li>Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+gestational+gene+transfer+of+IL-10+by+systemic+administration+of+lentiviral+vector+can+prevent+arthritis+in+a+murine+model.">Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model.</a> Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).</li><li>Reay, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-Length+Dystrophin+Gene+Transfer+to+the+Mdx+Mouse+in+utero.">Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero.</a> Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).</li><li>Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Mor&#225;n, M., Y&#225;&#241;ez-Mu&#241;oz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Transduction+of+Spinal+Cord+Motor+Neurons+by+Intrauterine+Delivery+of+Integration-Deficient+Lentiviral+Vectors.">High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors.</a> Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).</li><li>Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Brain-Directed+AAV+Gene+Therapy+Results+in+Rapid,+Robust,+and+Persistent+Transduction+of+Mouse+Choroid+Plexus+Epithelia.">Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).</li><li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+in+utero+transplantation.">A mouse model of in utero transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).</li><li>Davey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaagsiekte+Sheep+Retrovirus+Pseudotyped+Lentiviral+Vector-Mediated+Gene+Transfer+to+Fetal+Ovine+Lung.">Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung.</a> Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).</li></ol>

In utero transplantatie is een mogelijke therapie voor vele aangeboren stoornissen die vroeg in de zwangerschap kan worden gediagnosticeerd. De lymfkliertest model voor IUT kunnen onderzoekers om de foetale omgeving te verkennen of om te experimenteren met verschillende therapieën. Afhankelijk van wat wordt geïnjecteerd en wat wordt gericht, kan intraveneus of intra-vruchtwater in utero transplantatie zorgen voor een betrouwbare levering van een injectant in de gewenste ruimte.
<p class="jove_cont...

Recente vooruitgang in de prenatale screening en diagnose hebben gebracht aan het licht van de mogelijkheid om de foetus voor een aantal aangeboren aandoeningen die niet beschikt over voldoende postnatale behandelingsopties en leiden tot significante morbiditeit en mortaliteit te behandelen. In het bijzonder hebben in utero hematopoietische stamceltransplantatie (IUHCT) en bewerken van gen-therapie/genoom het potentieel om te profiteren van normale developmental eigenschappen van de foetus te behandelen aangeboren hematologic, immuun en genetische stoornissen efficiënter dan postnatale HSC-transplantatie en bewerken van gen-therapie/genoom1,2 doen kunnen. In het bijzonder als gevolg van de geringe omvang van de foetus, kan de donor cel of virale vector dosis worden gemaximaliseerd per het gewicht van de ontvanger. Bovendien kunt het immunologische onvolgroeidheid van de foetus donor HSCs te worden geïnjecteerd zonder de myeloablative en immunosuppressieve conditionering die is vereist in de postnatale transplantatie protocollen. Ook kunnen virale vectoren met een therapeutische transgenic of genoom bewerken technologie worden geïnjecteerd zonder een beperkende immune reactie op het transgenic product of de virale vector. Tot slot, de toegankelijkheid en proliferatieve aard van foetale stamcellen/voorlopercellen de mogelijkheid van een meer efficiënte transductie van voorlopercellen van het doel, evenals bepaalde vervoerswijzen genoom bewerken (homologie geleide reparatie) waarvoor fietsen cellen efficiënt optreden. De lymfkliertest model fungeert als een inzichtelijke en betaalbare manier inspelen op belangrijke vragen in stamcelbiologie en immunologie voorafgaand aan experimenteren in pre-klinische grote diermodellen en als zodanig heeft gediend als de primaire model waarin IUHCT en in de baarmoeder gentherapie geweest onderzocht1,2,3.
Hoewel veel variabelen een belangrijke rol in het succes van de IUHCT en in utero gene therapie/genoom bewerken in lymfkliertest en grote diermodellen spelen, is een belangrijke variabele de methode van levering van het HSCs of virale vector. De levering van grote doses van donor HSCs met een first-pass-effect optreedt in de foetale lever, het hematopoietische orgaan ten tijde van de IUHCT, is aangetoond dat bijdragen aan het bereiken van engraftment in muizen en grote diermodellen4 macrochimeric ,5. Dit werd bereikt via een injectie van donor cellen via de vitelline ader in de muismodel en via een intra cardiale injectie in het canine model. De route van injectie speelt ook een fundamentele rol in doelgerichtheid voorlopercellen van verschillende organen tijdens de ontwikkeling. Bijvoorbeeld, een intraveneuze injectie via de vitelline ader heeft aangetoond dat efficiënt transduce cardiomyocytes en hepatocyten na een late zwangerschap injectie6,7. U kunt ook kunt een intra-vruchtwater injectie van virale vectoren de doelgerichtheid van organen die fysiek zijn blootgesteld op basis van de embryonale vouwen/ontwikkeling ten tijde van de injectie-8. Dit is best geïllustreerd door de doelgerichtheid van het respiratoire epitheel via een intra-vruchtwater injectie laat in de dracht om te profiteren van normale foetale "ademen" bewegingen, die de luchtwegen naar de virale vector in het vruchtwater bloot vloeibare9. Deze twee modi van IUT, intraveneuze via de vitelline ader en intra-vruchtwater, zijn de basis voor meerdere afgelopen en lopende experimenten in ons laboratorium. In dit protocol beschrijven we in detail de methoden voor het uitvoeren van intraveneuze en intra-vruchtwater IUT in het lymfkliertest model.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Gloves</td>
			<td style="width:168px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:147px;">2D73DP65</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/ teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/o teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14075-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heavy Scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14002-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Needle Driver</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">12005-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vicryl 2.0</td>
			<td style="width:168px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">JB945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Transfer Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">GSI135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">MDS202000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">50 mL Conical tube</td>
			<td style="width:168px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Tape</td>
			<td style="width:168px;">3M</td>
			<td style="width:147px;">1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Eye lubricant</td>
			<td style="width:168px;">Major LubriFresh</td>
			<td style="width:147px;">0904-6488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:168px;">K&#38;H</td>
			<td style="width:147px;">3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:168px;">Leica</td>
			<td style="width:147px;">MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Injector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">HI01PK01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Glass Capillary tubes</td>
			<td style="width:168px;">Kimble</td>
			<td style="width:147px;">71900-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vertical Micropipette Puller</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Microelectrode Beveler</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">IM-300 Pneumatic Microinjector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">IM-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Insulin Syringe&#160;</td>
			<td style="width:168px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:147px;">305935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Filter</td>
			<td style="width:168px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:147px;">25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Compac5 Anesthesia Machine</td>
			<td style="width:168px;">VetEquip Compac5</td>
			<td style="width:147px;">901812&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:168px;">Piramal Critical Care</td>
			<td style="width:147px;">NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">N2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">NI 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">O2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">OX 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Ad-GFP viral vector</td>
			<td style="width:168px;">Penn Vector Core</td>
			<td style="width:147px;">H5&#39;.040.CMV.eGFP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model

In utero transplantatie (IUT) is een unieke en veelzijdige vorm van therapie die kan worden gebruikt om stamcellen, virale vectoren of andere stoffen in het begin van de dracht. De grondgedachte achter IUT voor therapeutische doeleinden is gebaseerd op de geringe omvang van de foetus, de foetale immunologische onvolwassenheid, de toegankelijkheid en proliferatieve aard van de foetale cellen van de stam of voorlopercellen, en het potentieel voor de behandeling van een ziekte of het begin van de symptomen voorafgaand aan de geboorte. Profiteren van deze normale developmental eigenschappen van de foetus, de levering van hematopoietische stamcellen (HSC) via een IUT heeft het potentieel voor de behandeling van aangeboren hematologic aandoeningen zoals sikkelcelziekte, zonder de vereiste myeloablative of immunosuppressieve conditionering vereist voor postnatale HSC-transplantatie. Ook voorziet de toegankelijkheid van voorlopercellen van meerdere organen tijdens de ontwikkeling mogelijk efficiënter richten van stam/voorlopercellen na een IUT van virale vectoren voor gentherapie of het bewerken van het genoom. Daarnaast, kan IUT worden gebruikt bij het bestuderen van normale ontwikkelings processen, met inbegrip van, maar niet beperkt tot, de ontwikkeling van immunologische tolerantie. Het lymfkliertest model levert een waardevolle en betaalbare methode om inzicht in de mogelijkheden en beperkingen van de IUT voorafgaand aan pre-klinische grote dierlijke studies en een uiteindelijke klinische toepassing. Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van een IUT in het lymfkliertest foetus via intraveneuze en intra-vruchtwater routes. Dit protocol heeft met succes gebruikt om het verhelderen van de noodzakelijke voorwaarden en mechanismen achter in utero hematopoietische stamceltransplantatie, inductie van de tolerantie en in utero gentherapie.

Overleving en engraftment zijn belangrijke maatstaf voor succes voor IUHCT experimenten. Afhankelijk van de specifieke eindpunten van een experiment, kunnen foetussen die een IUHCT ontvangen geïnduceerd door een C-section of postnatale stadium manifesteren worden geanalyseerd. Gemiddeld, variëren de overlevingskans van de patiënt na intraveneuze injecties van 75-100%. De overlevingskans van de patiënt na intra-vruchtwater injecties neiging om eerlijk beter dan intraveneuze injecties, ...

Watch this Scientific Journal Video about Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model at JoVE.com

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intraveneuze en Intra-vruchtwater In Utero transplantatie in het lymfkliertest Model

Beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van een transplantatie in utero (IUT) via intraveneuze en intra-vruchtwater routes van injectie in het lymfkliertest model. Dit protocol kan worden gebruikt om cellen, virale vectoren en andere stoffen in het unieke immuun-tolerante foetale milieu.

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in embryologie, gentherapie en stamceltransplantatie. Een voordeel van deze techniek is dat het analyse van de effecten van verschillende experimentele therapieën op Murine foetussen mogelijk maakt. Het aantonen van deze procedure zal artsen Nicholas Ahn, en Barbara Coons, artsen en onderzoekers in ons laboratorium.Voordat u met de procedure begint, laat u vijf tot 10 microliter steriele PBS in en uit de chirurgische naaldpunt vallen, twee tot drie keer om het van eventuele vuil te verwijderen. Vul vervolgens de naald met het reagens van belang bij het juiste experimentele volume en de concentratie. En druk drie keer op de modusknop op de micro-injector om door te gaan naar het kalibratiescherm.Voeg intervallen van 10 of 100 milliseconden toe om de injectietijd aan te passen en druk nog twee keer op de modusknop. Druk op de balansknop en druk één keer op het voetpedaal. Druk vervolgens opnieuw op het pedaal en beoordeel welk volume van de oplossing per duw uit de naald wordt geleegd.Wanneer de micro-injector is gekalibreerd op het juiste experimentele volume, vul de naald dan op het juiste niveau voor de injectie. Wanneer alle naalden zijn schoongemaakt, bevestig dan een gebrek aan reactie op teen snufje van de zwangere twee tot zes maanden oude vrouwelijke muis. Scheer de buik, zorg ervoor dat de tepels niet beschadigd worden en breng het dier over naar een verwarmingskussen in de supine-positie.Breng zalf aan op de ogen van het dier en zet de ledematen met tape vast op het verwarmingskussen. En desinfecteren de blootgestelde huid. Injecteer vervolgens lokale verdovingsmiddelen zoals 100 microliters van 0,25% Bupivacaine onderhuids.Maak vervolgens een huidincisie van één tot twee centimeter zodanig dat de onderste rand niet dichter dan één centimeter bij de introïsten is, en identificeer de middellijn van de fascia, waarbij u ervoor zorgt dat de omliggende epigastrische vaten niet worden verwond. Met behulp van Adson tangen, knijp de fascia zonder grijpen een van de onderliggende organen of foetussen, en open het weefsel met een schaar. Eenmaal veilig in de buikholte, breidt de fasciale incisie uit tot de lengte van de huidincisie en gebruik katoenen tip applicators om de darmen in het bovenste deel van de buik te verplaatsen om de gravid baarmoeder bloot te stellen.Haal de baarmoeder door de incisie zorgvuldig identificeren van de rechter en linker eierstokken om ervoor te zorgen dat alle foetussen worden geteld. Plaats de linker baarmoeder terug in de buik, zodat alleen de rechter baarmoeder wordt blootgesteld, om de niet geïnjecteerde foetussen warm te houden. En voorzichtig grijpen op de meest laterale vruchtzak tussen de duim en wijsvingers van de niet dominante hand.Plaats de dissectiemicroscoop over het dier en pas de focus en verlichting aan voor een betere visualisatie van de foetus indien nodig. Voor een intraveneuze injectie draai de baarmoeder, zodat de vitelline tevergeefs, te injecteren is parallel aan de naald tip. En leg de naald op de baarmoeder in een hoek van vijf graden om de baarmoederwand te doorboren.Met de punt tussen de baarmoederwand en de vruchtzak, plaats de tip direct boven op de vitelline tevergeefs en onder een bijna raaklijn hoek, glijden de naald over de ijdele totdat de schuine kant voorschotten in het vat. Het is noodzakelijk dat de hoek laag blijft, zodat de naald niet door de achterwand van het vat dringt. Wanneer een bloedvlek wordt waargenomen bij de naaldpunt, drukt u het voetpedaal om het volledige volume van het materiaal van belang in het vat te injecteren.Voor een intra vruchtzak, draai de vruchtzak totdat een locatie zonder vaten is gevonden. Richt de naald loodrecht op de baarmoederwand en doorboor de naald door de baarmoederdooierzak, en vruchtzak die ervoor zorgt dat er geen foetaal weefsel binnendringt. Injecteer vervolgens het gewenste materiaalvolume.Na beide soorten injectie, haal de naald uit de injectieplaats zodra het gewenste volume is geleverd. En ga naar de volgende foetus totdat alle foetussen van de rechter baarmoederhoorn zijn geïnjecteerd. Breng dan de rechter baarmoederhoorn terug in de buik.En verwijder de linker baarmoeder hoorn uit de buik. Wanneer alle foetussen in de linker hoorn zijn geïnjecteerd terug te keren de hele baarmoeder naar de buik, het verzorgen van een baarmoeder of darmvolvulus te voorkomen. Gebruik een wegwerp overdracht pipet om ongeveer twee milliliter steriele PBS in de buik af te zien, om eventuele ongevoelige verliezen te vervangen.En gebruik 4-0 polyglactine 910 hechtingen om de fascia en buik in één continue laag te sluiten. Breng de muis vervolgens over naar een schone kooi onder een warmtelamp met controle tot volledige recumbency. In dit trainingsexperiment vertoonden de levers van de foetussen die in-uterotransplantatie kregen door een cursist 24 uur na injectie lagere fluorescerende niveaus, als gevolg van een lagere engraftment van de getransplanteerde GFP-cellen, dan levers geïnjecteerd door een ervaren instructeur.Flow cytometrische analyse voor GFP positieve donorcellen ook gecorreleerd met het lagere niveau van fluorescerende waargenomen onder fluorescerende microscopie. Het vermogen van virale vectoren geleverd via de intra-vruchtwaterroute om cellen te transduceren in contact met het vruchtwater. Wordt geïllustreerd door de transductie van epitheliale cellen 48 uur na de in utero-injectie van het Adeno-virus dat het GFP-transgene draagt in zwangerschapsdag 12,5 foetussen.Eenmaal onder de knie deze techniek kan worden voltooid in 15-25 minuten per zwangere muis. Na het bekijken van deze video moet je een goed begrip van hoe veilig en effectief leveren verschillende therapieën aan de muis foetussen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Ruimtelijke en temporele analyse van Active ERK in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Kiembaan

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Cultuur van muizen embryonale Middenvoetsbeentjes: Een Fysiologische Model van endochondrale Verbening

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Een nieuwe Mammary Fat Pad Transplantation Technique om de Vessel Generation van Vasculaire Endotheliale Stamcellen te visualiseren

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Toepassing van RNAi en warmte-schok-geïnduceerde transcriptie Factor expressie te herprogrammeren kiemcellen aan neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-gemedieerde verlies van functie analyse in cerebellaire submodule cellen gebruiken In Utero Electroporation gebaseerde gentransfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...