Name: intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model
Uploaded: 2018-10-09T13:00:00
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Les protocoles expérimentaux ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à hôpital le de Philadelphie enfants et d’institutionnels animalier.
1. création des Pipettes d’Injection
<ol><li>À l’aide d’une verticale de micropipettes, tirez une pipette de microcapillaire 100 µL (Figure 1 a - 1C). Calibrer les micropipettes afin que l’extrémité effilée est > 1 cm de long. Remarque : Au début, les paramètres de l’ex...

<ol>
	<li>Loukogeorgakis, S., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+stem+cell+and+gene+therapy:+current+status+and+future+perspectives.">In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives.</a> European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).</li><li>Vrecenak, J., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+hematopoietic+cell+transplantation:+recent+progress+and+the+potential+for+clinical+application.">In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application.</a> Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+murine+hemoglobinopathies+by+prenatal+tolerance+induction+and+postnatal+nonmyeloablative+allogeneic+BM+transplants.">Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants.</a> Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).</li><li>Vrecenak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Long-Term+Mixed+Chimerism+Achieved+in+a+Canine+Model+of+Allogeneic+in+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD26+Inhibition+Enhances+Allogeneic+Donor-Cell+Homing+and+Engraftment+after+in+utero+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).</li><li>Waddington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+gene+transfer+of+human+factor+IX+to+fetal+mice+can+induce+postnatal+tolerance+of+the+exogenous+clotting+factor.">In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor.</a> Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).</li><li>Stitelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Stage+Determines+Efficiency+of+Gene+Transfer+to+Muscle+Satellite+Cells+by+in+utero+Delivery+of+Adeno-Associated+Virus+Vector+Serotype+2/9.">Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 1, 14040 (2014).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Transfer+to+Ocular+Stem+Cells+by+Early+Gestational+Intraamniotic+Injection+of+Lentiviral+Vector.">Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector.</a> Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).</li><li>Boelig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intravenous+Route+of+Injection+Optimizes+Engraftment+and+Survival+in+the+Murine+Model+of+In+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-amniotic+Transient+Transduction+of+the+Periderm+with+a+Viral+Vector+Encoding+TGF&#946;3+Prevents+Cleft+Palate+in+Tgf&#946;3-/-.+Mouse+Embryos.">Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGF&#946;3 Prevents Cleft Palate in Tgf&#946;3-/-. Mouse Embryos.</a> Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).</li><li>Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+gestational+gene+transfer+of+IL-10+by+systemic+administration+of+lentiviral+vector+can+prevent+arthritis+in+a+murine+model.">Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model.</a> Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).</li><li>Reay, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-Length+Dystrophin+Gene+Transfer+to+the+Mdx+Mouse+in+utero.">Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero.</a> Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).</li><li>Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Mor&#225;n, M., Y&#225;&#241;ez-Mu&#241;oz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Transduction+of+Spinal+Cord+Motor+Neurons+by+Intrauterine+Delivery+of+Integration-Deficient+Lentiviral+Vectors.">High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors.</a> Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).</li><li>Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Brain-Directed+AAV+Gene+Therapy+Results+in+Rapid,+Robust,+and+Persistent+Transduction+of+Mouse+Choroid+Plexus+Epithelia.">Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).</li><li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+in+utero+transplantation.">A mouse model of in utero transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).</li><li>Davey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaagsiekte+Sheep+Retrovirus+Pseudotyped+Lentiviral+Vector-Mediated+Gene+Transfer+to+Fetal+Ovine+Lung.">Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung.</a> Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).</li></ol>

In utero de transplantation est un traitement potentiel pour plusieurs maladies congénitales qui peuvent être diagnostiqués au début de la gestation. Le modèle murin pour l’IUT permet aux chercheurs d’explorer l’environnement foetal ou d’expérimenter avec différentes thérapies. Selon ce qui est en train d’injecter et ce qui est visé, par voie intraveineuse ou amniotique le dans l’utérus de la transplantation peut fournir une prestation fiable d’un quelle dans l’espace désiré....

Les progrès récents dans le diagnostic et le dépistage prénatal ont mis en lumière la possibilité de traiter le fœtus pour un certain nombre de troubles congénitaux qui ne pas avoir les options de traitement postnatal adéquat et entraîner une morbidité et mortalité. Plus précisément, dans l’utérus de transplantation de cellules souches hématopoïétiques (IUHCT) et d’édition de thérapie/génome gène ont le potentiel pour profiter des propriétés du développement normales du foetus pour traiter congénitale hématologique, immunitaires et génétiques les troubles de manière plus efficace que la greffe de CSH postnatal et édition de thérapie/génome gène peuvent faire1,2. Plus précisément, en raison de la petite taille du foetus, la cellule du donneur ou la dose de vecteur viral peut être agrandie par le poids du destinataire. En outre, l’immaturité immunitaire du foetus permet de donateurs CSH à doser sans myéloablatif et immunosuppresseurs conditionnement qui est requise dans protocoles greffe postnatal. De même, les vecteurs viraux transportant un transgène thérapeutique ou la technologie d’édition du génome peuvent être injectés sans une réponse immunitaire limitante le produit transgénique ou le vecteur viral. Enfin, l’accessibilité et la nature proliférative des cellules souches/progénitrices foetale s’offrir la possibilité d’une transduction plus efficace des cellules progénitrices de cibles, ainsi que certains modes de génome édition (axés sur l’homologie réparation) qui nécessitent de cyclisme cellules se produire efficacement. Le modèle murin constitue un moyen perspicace et abordable pour répondre à des questions importantes dans la biologie des cellules souches et immunologie avant d’expérimenter dans des modèles animaux grands précliniques et, à ce titre, a été le modèle primaire dans laquelle IUHCT et dans l’utérus la thérapie génique ont été explorés1,2,3.
Bien que de nombreuses variables jouent un rôle important dans le succès de IUHCT et dans l’utérus gene therapy/génome édition dans des modèles murins et grands animaux, une variable-clé est la méthode de livraison des CSH ou des vecteurs viraux. La livraison de grandes quantités de donateur CSH avec un effet de premier passage dans le foie fœtal, les organes hématopoïétiques au moment de la IUHCT, s’est avérée être contribué à atteindre un niveau de prise de greffe dans les souris et les modèles animaux grands4 macrochimeric ,,5. Ceci a été réalisé via une injection de donateurs cellules via la veine vitelline chez la souris et via une injection intracardiaque dans le modèle canin. La voie d’injection joue également un rôle fondamental dans le ciblage des cellules progénitrices de différents organes au cours du développement. Par exemple, une injection intraveineuse par l’intermédiaire de la veine vitelline a été démontrée à transmettre efficacement les cardiomyocytes et hépatocytes suite à une fin de gestation injection6,7. Par ailleurs, une injection intra-amniotique de vecteurs viraux permet le ciblage des organes qui affleurent physiquement basés sur le pliage/développement embryonnaire au moment de l’injection de8. Ceci est mieux illustré par le ciblage de l’épithélium respiratoire via une injection intra-amniotique vers la fin de la gestation pour profiter de mouvements normaux foetale « breathing », qui expose les voies respiratoires au vecteur viral dans l’amniotique fluide de9. Ces deux modes de l’IUT, par voie intraveineuse via la veine vitelline et amniotique, ont servi de base à plusieurs des expériences passées et en cours dans notre laboratoire. Dans ce protocole, nous décrivons en détail les méthodes permettant d’effectuer par voie intraveineuse et amniotique IUT dans le modèle murin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Gloves</td>
			<td style="width:168px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:147px;">2D73DP65</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/ teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/o teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14075-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heavy Scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14002-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Needle Driver</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">12005-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vicryl 2.0</td>
			<td style="width:168px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">JB945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Transfer Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">GSI135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">MDS202000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">50 mL Conical tube</td>
			<td style="width:168px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Tape</td>
			<td style="width:168px;">3M</td>
			<td style="width:147px;">1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Eye lubricant</td>
			<td style="width:168px;">Major LubriFresh</td>
			<td style="width:147px;">0904-6488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:168px;">K&#38;H</td>
			<td style="width:147px;">3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:168px;">Leica</td>
			<td style="width:147px;">MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Injector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">HI01PK01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Glass Capillary tubes</td>
			<td style="width:168px;">Kimble</td>
			<td style="width:147px;">71900-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vertical Micropipette Puller</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Microelectrode Beveler</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">IM-300 Pneumatic Microinjector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">IM-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Insulin Syringe&#160;</td>
			<td style="width:168px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:147px;">305935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Filter</td>
			<td style="width:168px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:147px;">25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Compac5 Anesthesia Machine</td>
			<td style="width:168px;">VetEquip Compac5</td>
			<td style="width:147px;">901812&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:168px;">Piramal Critical Care</td>
			<td style="width:147px;">NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">N2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">NI 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">O2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">OX 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Ad-GFP viral vector</td>
			<td style="width:168px;">Penn Vector Core</td>
			<td style="width:147px;">H5&#39;.040.CMV.eGFP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model

In utero transplantation (IUT) est un mode de thérapie qui peut être utilisé pour introduire des cellules souches, vecteurs viraux ou toute autre substance au début de la gestation unique et polyvalent. La logique de l’IUT à des fins thérapeutiques est issue de la petite taille du foetus, l’immaturité immunologique fœtale, l’accessibilité et la nature proliférative des cellules souches ou progénitrices foetales et le potentiel pour traiter une maladie ou l’apparition des symptômes avant la naissance. Profitant de ces propriétés du développement normales du foetus, la livraison de cellules souches hématopoïétiques (CSH) via un IUT a le potentiel pour traiter des troubles hématologiques congénitales comme la drépanocytose, sans le besoin myéloablatif ou immunosuppresseur conditionnement nécessaire pour les greffes de CSH postnatal. De même, l’accessibilité des cellules progénitrices dans plusieurs organes au cours du développement potentiellement permet un ciblage plus efficace des cellules souches/progénitrices après un IUT de vecteurs viraux de thérapie génique ou la modification du génome. En outre, IUT peut être utilisé pour étudier les processus de développement normales y compris, mais sans s’y limiter, le développement de la tolérance immunologique. Le modèle murin fournit un moyen précieux et abordable pour comprendre le potentiel et les limites de l’IUT avant des gros animaux études précliniques et une éventuelle application clinique. Nous décrivons ici un protocole permettant d’effectuer un IUT dans le fœtus murin par voies intraveineuse et amniotique. Ce protocole a été utilisé avec succès pour élucider les conditions nécessaires et les mécanismes à l’origine dans l’utérus la transplantation de cellules souches hématopoïétiques, induction de la tolérance et dans l’utérus la thérapie génique.

Survie et la greffe sont des mesures importantes de réussite pour les expériences IUHCT. Selon les paramètres spécifiques d’une expérience, foetus qui a reçu un IUHCT peuvent être analysés avant la naissance par une césarienne ou après la naissance. En moyenne, les taux de survie après injections intraveineuses vont de 75 à 100 %. Le taux de survie après injections amniotique tendance à fair mieux que des injections intraveineuses, aux alentours de 85 à 100 %.
<p clas...

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Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intraveineuse amniotique et In Utero une Transplantation chez le modèle murin

Les auteurs décrivent un protocole permettant d’effectuer une transplantation in utero (IUT) par voies intraveineuse et amniotique d’injection dans le modèle murin. Ce protocole peut être utilisé pour introduire des cellules, vecteurs viraux et autres substances dans l’environnement unique de tolérance immunitaire fœtal.

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en embryologie, thérapie génique et transplantation de cellules souches. Un avantage de cette technique est qu’elle permet l’analyse des effets de différentes thérapies expérimentales sur les fœtus murins. Les médecins Nicholas Ahn et Barbara Coons, médecins et chercheurs de notre laboratoire, démontreront cette procédure.Avant de commencer l’intervention, laissez tomber de cinq à dix microlitres de PBS stérile dans et hors de la pointe de l’aiguille chirurgicale, deux à trois fois pour l’effacer de tout débris possible. Ensuite, remplissez l’aiguille avec le reagent d’intérêt au volume expérimental approprié et la concentration. Et appuyez trois fois sur le bouton mode sur le micro-injecteur pour passer à l’écran d’étalonnage d’injection.Ajoutez des intervalles de 10 ou 100 millisecondes pour ajuster le temps d’injection et appuyez deux fois de plus sur le bouton mode. Appuyez sur le bouton d’équilibre et appuyez sur la pédale une fois. Appuyez ensuite à nouveau sur la pédale et évaluez le volume de solution qui est vidé de l’aiguille par poussée.Lorsque le micro-injecteur est calibré au volume expérimental approprié, remplissez l’aiguille au bon niveau pour l’injection. Lorsque toutes les aiguilles ont été nettoyées, confirmer un manque de réponse à la pincée d’ateil de la souris femelle enceinte de deux à six mois. Raser l’abdomen, en prenant soin de ne pas endommager les mamelons, et transférer l’animal à un coussin chauffant en position supine.Appliquez de la pommade sur les yeux de l’animal et fixez les membres sur le coussin chauffant avec du ruban adhésif. Et désinfecter la peau exposée. Injectez ensuite des anesthésiques locaux tels que 100 microlitres de 0,25%Bupivacaine sous-cutanée.Ensuite, faire une incision cutanée d’un à deux centimètres de telle sorte que la bordure inférieure n’est pas plus proche d’un centimètre de l’introitus, et d’identifier la ligne médiane du fascia, en prenant soin de ne pas blesser les vaisseaux épigastriques environnants. À l’aide de forceps Adson, pincez le fascia sans saisir aucun des organes sous-jacents ou des fœtus, et ouvrez le tissu avec des ciseaux. Une fois en toute sécurité dans la cavité abdominale, étendre l’incision fasciale à la longueur de l’incision cutanée, et utiliser des applicateurs pointe de coton pour déplacer les intestins dans la partie supérieure de l’abdomen pour exposer l’utérus gravide.Extraire l’utérus par l’incision en identifiant soigneusement les ovaires droit et gauche pour s’assurer que tous les fœtus sont comptés. Remettre l’utérus gauche dans l’abdomen afin que seul l’utérus droit soit exposé, afin de garder les fœtus non injectés au chaud. Et saisissez doucement au sac amniotique le plus latéral entre le pouce et les index de la main non dominante.Placez le microscope de dissection au-dessus de l’animal et ajustez la mise au point et l’éclairage pour une meilleure visualisation du foetus si nécessaire. Pour une injection intraveineuse faire pivoter l’utérus de sorte que la vitelline vaine, à injecter est parallèle à la pointe de l’aiguille. Et poser l’aiguille sur l’utérus à un angle de cinq degrés pour percer la paroi utérine.Avec la pointe entre la paroi utérine et le sac amniotique, placez la pointe directement au sommet de la vitelline vaine et à un angle presque tangentiel, glissez l’aiguille sur le vain jusqu’à ce que le biseau avance dans le navire. Il est impératif que l’angle reste bas afin que l’aiguille ne pénètre pas dans la paroi arrière du navire. Lorsqu’une tache de sang est observée à l’extrémité de l’aiguille, appuyer sur la pédale pour injecter tout le volume du matériau d’intérêt dans le récipient.Pour une injection intra-amniotique, faites pivoter le sac amniotique jusqu’à ce qu’un endroit dépourvu de vaisseaux soit trouvé. Pointez l’aiguille perpendiculairement à la paroi utérine et percez l’aiguille à travers le sac de jaune d’utérus, et sac amniotique en prenant soin de ne pénétrer aucun tissu fœtal. Injectez ensuite le volume approprié de matériel désiré.Après l’un ou l’autre type d’injection, retirez l’aiguille du site d’injection une fois que le volume désiré est livré. Et procéder au fœtus suivant jusqu’à ce que tous les fœtus de la corne utérine droite ont été injectés. Puis retourner la corne utérine droite dans l’abdomen.Et retirez la corne utérine gauche de l’abdomen. Lorsque tous les fœtus de la corne gauche ont été injectés retourner l’utérus entier à l’abdomen, en prenant soin d’éviter un volvulus utérin ou intestinal. Utilisez une pipette de transfert jetable pour distribuer environ deux millilitres de PBS stérile dans l’abdomen, pour remplacer les pertes insensibles.Et utilisez 4-0 sutures de polyglactine 910 pour fermer le fascia et l’abdomen en une seule couche continue. Ensuite, transférez la souris dans une cage propre sous une lampe thermique avec surveillance jusqu’à ce que la pleine couchée. Dans cette expérience de formation, les foies des fœtus qui ont reçu une transplantation in utero par un stagiaire ont affiché des niveaux fluorescents inférieurs 24 heures après l’injection, en raison d’un engraftment inférieur des cellules GFP transplantées, que les foies injectés par un instructeur expérimenté.L’analyse cytométrique de flux pour les cellules positives de donneur de GFP a également corrélé avec le niveau inférieur des fluorescents observés sous la microscopie fluorescente. La capacité des vecteurs viraux livrés par voie intra-amniotique à transduire les cellules en contact avec le liquide amniotique. Est illustré par la transduction de cellules épithéliales 48 heures après l’injection in utero du virus Adeno portant le transgène GFP dans le jour gestationnel 12,5 fœtus.Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en 15-25 minutes par souris enceinte. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de fournir en toute sécurité et efficacement différentes thérapies aux fœtus de souris.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Recherche

Biologie du développement

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