Name: intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model
Uploaded: 2018-10-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model at JoVE.com

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को संस्थागत पशु देखभाल और फिलाडेल्फिया के बच्चों के अस्पताल में उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. इंजेक्शन पिपेट का निर्माण
<ol><li>एक ऊर्ध्वाधर micropipette खींचने का उप...

<ol>
	<li>Loukogeorgakis, S., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+stem+cell+and+gene+therapy:+current+status+and+future+perspectives.">In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives.</a> European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).</li><li>Vrecenak, J., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+hematopoietic+cell+transplantation:+recent+progress+and+the+potential+for+clinical+application.">In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application.</a> Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+murine+hemoglobinopathies+by+prenatal+tolerance+induction+and+postnatal+nonmyeloablative+allogeneic+BM+transplants.">Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants.</a> Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).</li><li>Vrecenak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Long-Term+Mixed+Chimerism+Achieved+in+a+Canine+Model+of+Allogeneic+in+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD26+Inhibition+Enhances+Allogeneic+Donor-Cell+Homing+and+Engraftment+after+in+utero+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).</li><li>Waddington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+gene+transfer+of+human+factor+IX+to+fetal+mice+can+induce+postnatal+tolerance+of+the+exogenous+clotting+factor.">In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor.</a> Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).</li><li>Stitelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Stage+Determines+Efficiency+of+Gene+Transfer+to+Muscle+Satellite+Cells+by+in+utero+Delivery+of+Adeno-Associated+Virus+Vector+Serotype+2/9.">Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 1, 14040 (2014).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Transfer+to+Ocular+Stem+Cells+by+Early+Gestational+Intraamniotic+Injection+of+Lentiviral+Vector.">Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector.</a> Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).</li><li>Boelig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intravenous+Route+of+Injection+Optimizes+Engraftment+and+Survival+in+the+Murine+Model+of+In+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-amniotic+Transient+Transduction+of+the+Periderm+with+a+Viral+Vector+Encoding+TGF&#946;3+Prevents+Cleft+Palate+in+Tgf&#946;3-/-.+Mouse+Embryos.">Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGF&#946;3 Prevents Cleft Palate in Tgf&#946;3-/-. Mouse Embryos.</a> Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).</li><li>Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+gestational+gene+transfer+of+IL-10+by+systemic+administration+of+lentiviral+vector+can+prevent+arthritis+in+a+murine+model.">Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model.</a> Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).</li><li>Reay, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-Length+Dystrophin+Gene+Transfer+to+the+Mdx+Mouse+in+utero.">Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero.</a> Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).</li><li>Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Mor&#225;n, M., Y&#225;&#241;ez-Mu&#241;oz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Transduction+of+Spinal+Cord+Motor+Neurons+by+Intrauterine+Delivery+of+Integration-Deficient+Lentiviral+Vectors.">High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors.</a> Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).</li><li>Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Brain-Directed+AAV+Gene+Therapy+Results+in+Rapid,+Robust,+and+Persistent+Transduction+of+Mouse+Choroid+Plexus+Epithelia.">Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).</li><li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+in+utero+transplantation.">A mouse model of in utero transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).</li><li>Davey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaagsiekte+Sheep+Retrovirus+Pseudotyped+Lentiviral+Vector-Mediated+Gene+Transfer+to+Fetal+Ovine+Lung.">Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung.</a> Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).</li></ol>

utero प्रत्यारोपण में कई जंमजात विकारों कि जल्दी हमल में निदान किया जा सकता है के लिए एक संभावित चिकित्सा है । IUT के लिए murine मॉडल शोधकर्ताओं भ्रूण पर्यावरण का पता लगाने के लिए या विभिन्न उपचारों के साथ प्?...

प्रसवपूर्व स्क्रीनिंग और निदान में हाल ही में अग्रिमों जन्मजात विकारों जो पर्याप्त जन्मोत्तर उपचार के विकल्प और महत्वपूर्ण रुग्णता और मृत्यु दर में परिणाम नहीं है की एक संख्या के लिए भ्रूण के इलाज की संभावना को प्रकाश में लाया है । विशेष रूप से, utero टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण में (IUHCT) और जीन चिकित्सा/जीनोम संपादन करने के लिए भ्रूण के सामांय विकासात्मक गुणों का लाभ लेने के लिए जंमजात hematologic, प्रतिरक्षा, और आनुवंशिक का इलाज करने की क्षमता है जन्मोत्तर HSC प्रत्यारोपण और जीन थेरेपी से अधिक कुशलता से विकारों/जीनोम संपादन1,2कर सकते हैं । विशेष रूप से, भ्रूण के छोटे आकार के कारण, दाता कोशिका या वायरल वेक्टर खुराक प्राप्तकर्ता के वजन के अनुसार अधिकतम किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, भ्रूण की immunologic अपरिपक्वता दाता HSCs myeloablative और immunosuppressive कंडीशनिंग कि जन्मोत्तर प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल में आवश्यक है बिना इंजेक्शन हो सकता है । इसी तरह, वायरल वैक्टर एक चिकित्सीय transgene या जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी ले जाने के लिए या तो transgene उत्पाद या वायरल वेक्टर एक सीमित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बिना इंजेक्ट किया जा सकता है । अंत में, भ्रूण स्टेम/जनक कोशिकाओं की पहुंच और प्रफलन प्रकृति लक्ष्य जनक कोशिकाओं की एक अधिक कुशल transduction की संभावना है, साथ ही जीनोम संपादन के कुछ तरीके (समरूपता-मरंमत निर्देशित) जो साइकिल चालन की आवश्यकता कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक होने के लिए । murine मॉडल के रूप में कार्य करता है एक व्यावहारिक और सस्ती करने के लिए स्टेम सेल जीव विज्ञान और इम्यूनोलॉजी में महत्वपूर्ण सवालों के पूर्व नैदानिक बड़े पशु मॉडल में प्रयोग करने से पहले और पता है, जैसे, प्राथमिक मॉडल के रूप में सेवा की है जिसमें IUHCT और utero में जीन थेरेपी में1,2,3का पता लगाया गया है ।
हालांकि कई चर IUHCT की सफलता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है और utero जीन थेरेपी में/murine और बड़े पशु मॉडल में जीनोम संपादन, एक महत्वपूर्ण चर HSCs या वायरल वेक्टर के वितरण की विधि है । भ्रूण जिगर में होने वाले पहले से गुजारें प्रभाव के साथ दाता HSCs की बड़ी खुराक का वितरण, IUHCT के समय में टेम अंग, माउस और बड़े पशु मॉडल में engraftment के macrochimeric स्तर को प्राप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई होने के लिए दिखाया गया है4 ,5. यह माउस मॉडल में vitelline नस और कुत्ते मॉडल में एक इंट्रा कार्डियक इंजेक्शन के माध्यम से दाता कोशिकाओं के एक इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त किया गया था । इंजेक्शन का मार्ग भी विकास के दौरान विभिन्न अंगों की जनक कोशिकाओं को लक्षित करने में एक मौलिक भूमिका निभाता है । उदाहरण के लिए, vitelline नस के माध्यम से एक नसों में इंजेक्शन एक देर से हमल इंजेक्शन6,7के बाद कुशलता से transduce cardiomyocytes और हेपैटोसाइट्स करने के लिए दिखाया गया है । वैकल्पिक रूप से, वायरल वैक्टर के एक इंट्रा एमनियोटिक इंजेक्शन अंगों के लक्ष्यीकरण की अनुमति देता है कि शारीरिक रूप से भ्रूण तह के आधार पर उजागर कर रहे हैं/ इस एमनियोटिक में वायरल वेक्टर के लिए श्वसन तंत्र को उजागर करता है जो सामान्य भ्रूण "श्वास" आंदोलनों, का लाभ लेने के लिए देर से एक इंट्रा-एमनियोटिक इंजेक्शन के माध्यम से श्वसन उपकला के लक्ष्यीकरण द्वारा सबसे अच्छा उदाहरण है द्रव9. IUT के इन दो मोड, vitelline नस और इंट्रा एमनियोटिक के माध्यम से नसों में, हमारी प्रयोगशाला में कई अतीत और चल रहे प्रयोगों के लिए आधार किया गया है । इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से murine मॉडल में नसों में और इंट्रा-एमनियोटिक IUT प्रदर्शन के लिए तरीकों का वर्णन ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Gloves</td>
			<td style="width:168px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:147px;">2D73DP65</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/ teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/o teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14075-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heavy Scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14002-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Needle Driver</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">12005-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vicryl 2.0</td>
			<td style="width:168px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">JB945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Transfer Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">GSI135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">MDS202000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">50 mL Conical tube</td>
			<td style="width:168px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Tape</td>
			<td style="width:168px;">3M</td>
			<td style="width:147px;">1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Eye lubricant</td>
			<td style="width:168px;">Major LubriFresh</td>
			<td style="width:147px;">0904-6488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:168px;">K&#38;H</td>
			<td style="width:147px;">3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:168px;">Leica</td>
			<td style="width:147px;">MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Injector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">HI01PK01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Glass Capillary tubes</td>
			<td style="width:168px;">Kimble</td>
			<td style="width:147px;">71900-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vertical Micropipette Puller</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Microelectrode Beveler</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">IM-300 Pneumatic Microinjector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">IM-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Insulin Syringe&#160;</td>
			<td style="width:168px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:147px;">305935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Filter</td>
			<td style="width:168px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:147px;">25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Compac5 Anesthesia Machine</td>
			<td style="width:168px;">VetEquip Compac5</td>
			<td style="width:147px;">901812&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:168px;">Piramal Critical Care</td>
			<td style="width:147px;">NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">N2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">NI 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">O2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">OX 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Ad-GFP viral vector</td>
			<td style="width:168px;">Penn Vector Core</td>
			<td style="width:147px;">H5&#39;.040.CMV.eGFP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model

utero ट्रांसप्लांटेशन (IUT) में चिकित्सा कि स्टेम सेल, वायरल वैक्टर, या किसी भी अंय पदार्थों जल्दी हमल में शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक अद्वितीय और बहुमुखी मोड है । चिकित्सीय प्रयोजनों के लिए IUT के पीछे तर्क भ्रूण के छोटे आकार पर आधारित है, भ्रूण immunologic अपरिपक्वता, भ्रूण स्टेम या जनक कोशिकाओं की पहुंच और प्रफलन प्रकृति, और एक रोग या लक्षणों की शुरुआत का इलाज करने की क्षमता जंम से पहले । भ्रूण के इन सामान्य विकास के गुणों का लाभ उठाते हुए, एक IUT के माध्यम से टेम स्टेम सेल (HSC) के वितरण की आवश्यकता के बिना सिकल सेल रोग जैसे जन्मजात hematologic विकारों का इलाज करने की क्षमता है जन्मोत्तर HSC प्रत्यारोपण के लिए myeloablative या immunosuppressive कंडीशनिंग आवश्यक है । इसी प्रकार, विकास के दौरान कई अंगों में जनक कोशिकाओं की पहुंच संभावित जीन थेरेपी या जीनोम संपादन के लिए वायरल वैक्टर के एक IUT के बाद स्टेम/जनक कोशिकाओं के एक अधिक कुशल लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है । इसके अतिरिक्त, IUT सहित सामांय विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जा सकता है, लेकिन सीमित नहीं है, immunologic सहिष्णुता के विकास । murine मॉडल एक मूल्यवान और सस्ती IUT की क्षमता और सीमाओं को समझने के पूर्व नैदानिक बड़े पशु अध्ययन और एक अंतिम नैदानिक आवेदन करने के लिए साधन प्रदान करता है । यहां, हम नसों और इंट्रा एमनियोटिक मार्गों के माध्यम से murine भ्रूण में एक IUT प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है के लिए आवश्यक शर्तों और utero टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण, सहनशीलता प्रेरण में पीछे तंत्र स्पष्ट, और utero जीन थेरेपी में ।

अस्तित्व और engraftment IUHCT प्रयोगों के लिए सफलता के महत्वपूर्ण उपाय हैं. एक प्रयोग के विशिष्ट समापन पर निर्भर करता है, भ्रूण है कि एक IUHCT प्राप्त एक सी-खंड या postnatally द्वारा जंम के पूर्व का विश्लेषण किया ...

Watch this Scientific Journal Video about Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model at JoVE.com

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Murine मॉडल में Utero ट्रांसप्लांटेशन में नसों और इंट्रा-एमनियोटिक

हम नसों और murine मॉडल में इंजेक्शन के इंट्रा-एमनियोटिक मार्गों के माध्यम से utero प्रत्यारोपण (IUT) में एक प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल अद्वितीय प्रतिरक्षा सहिष्णु भ्रूण वातावरण में कोशिकाओं, वायरल वैक्टर, और अंय पदार्थों को लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

इस विधि भ्रूण विज्ञान, जीन थेरेपी और स्टेम सेल प्रत्यारोपण में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब में मदद कर सकते हैं । इस तकनीक के लिए एक लाभ यह है कि यह मुरीन भ्रूण पर विभिन्न प्रयोगात्मक चिकित्सा के प्रभावों के विश्लेषण को सक्षम बनाता है। इस प्रक्रिया का प्रदर्शन डॉक्टरों निकोलस Ahn, और बारबरा Coons, चिकित्सकों और हमारी प्रयोगशाला में अनुसंधान अध्येता होगा ।प्रक्रिया शुरू करने से पहले, किसी भी संभावित मलबे को साफ करने के लिए दो से तीन बार सर्जिकल सुई टिप में और बाहर बाँझ पीबीएस के पांच से 10 माइक्रोलीटर छोड़ दें। अगले उचित प्रयोगात्मक मात्रा और एकाग्रता पर ब्याज के अभिवात के साथ सुई भरें। और इंजेक्शन अंशांकन स्क्रीन पर आगे बढ़ने के लिए माइक्रो इंजेक्टर पर तीन बार मोड बटन दबाएं।इंजेक्शन समय को समायोजित करने के लिए 10 या 100 मिलीसेकंड के अंतराल जोड़ें, और मोड बटन को दो बार और दबाएं। बैलेंस बटन दबाएं और एक बार पैर पेडल पुश करें। फिर पेडल को फिर से दबाएं और आकलन करें कि प्रति पुश सुई से समाधान की मात्रा खाली हो जाती है।जब माइक्रो इंजेक्टर को उचित प्रयोगात्मक मात्रा में कैलिब्रेट किया जाता है, तो इंजेक्शन के लिए सुई को सही स्तर तक भरें। जब सभी सुइयों को साफ कर दिया गया है, तो गर्भवती दो से छह महीने पुरानी मादा माउस के अंगुली चुटकी के जवाब की कमी की पुष्टि करें। पेट को शेव करें, निपल्स को नुकसान न पहुंचाने का ध्यान रखें, और जानवर को रीढ़ की स्थिति में हीटिंग पैड में स्थानांतरित करें।जानवर की आंखों पर मरहम लगाएं और अंगों को टेप के साथ हीटिंग पैड पर सुरक्षित करें। और उजागर त्वचा कीटाणुरहित करें। फिर स्थानीय एनेस्थेटिक्स जैसे 0.25% बुपिवाकेन के 100 माइक्रोलीटर को चमड़े के रूप में इंजेक्ट करें।इसके बाद, एक से दो सेंटीमीटर त्वचा चीरा लें ताकि निचली सीमा अंतर्मुखी लोगों के लिए एक सेंटीमीटर से अधिक न हो, और प्रावरणी के मिडलाइन की पहचान करे, जिससे आसपास के एपिगैस्ट्रिक जहाजों को घायल न किया जा सके। एडसन संदंश का उपयोग करना, अंतर्निहित अंगों या भ्रूण में से किसी को हथियाने के बिना प्रावरणी चुटकी, और कैंची के साथ ऊतक खुला । एक बार सुरक्षित रूप से पेट की गुहा के भीतर, त्वचा चीरा की लंबाई के लिए fascial चीरा का विस्तार, और कपास टिप applicators का उपयोग करने के लिए पेट के ऊपरी हिस्से में आंतों को स्थानांतरित करने के लिए ग्रेविड गर्भाशय का पर्दाफाश ।चीरा के माध्यम से गर्भाशय निकालें ध्यान से सही और बाएं अंडाशय की पहचान करने के लिए सुनिश्चित करें कि भ्रूण के सभी गिना जाता है । बाएं गर्भाशय को वापस पेट में रखें ताकि गैर इंजेक्शन वाले भ्रूण को गर्म रखने के लिए केवल सही गर्भाशय सामने आ सके। और धीरे-धीरे गैर प्रमुख हाथ के अंगूठे और सूचकांक उंगलियों के बीच सबसे पार्श्व एमनियोटिक थैली पर समझ।जानवर पर विच्छेदन माइक्रोस्कोप की स्थिति और आवश्यक के रूप में भ्रूण के एक बेहतर दृश्य के लिए ध्यान और प्रकाश व्यवस्था को समायोजित करें। एक नसों में इंजेक्शन के लिए गर्भाशय को घुमाते हैं ताकि विटेलिन व्यर्थ हो, इंजेक्शन लगाया जाना सुई टिप के समानांतर हो। और गर्भाशय की दीवार को छेदने के लिए गर्भाशय पर सुई को पांच डिग्री कोण पर रखना।गर्भाशय की दीवार और एमनियोटिक थैली के बीच की नोक के साथ, टिप को सीधे विटेललाइन व्यर्थ के ऊपर रखें और लगभग स्पर्शरेखा कोण पर, तब तक व्यर्थ पर सुई को फिसलना जब तक कि बेजल पोत में आगे न आ जाए। यह जरूरी है कि कोण कम रहता है ताकि सुई पोत की पिछली दीवार में प्रवेश न करे। जब सुई की नोक पर रक्त का एक स्थान मनाया जाता है, तो पोत में ब्याज की सामग्री की पूरी मात्रा को इंजेक्ट करने के लिए पैर पेडल दबाएं।इंट्रा एमनियोटिक इंजेक्शन के लिए, एमनियोटिक थैली को तब तक घुमाएं जब तक कि जहाजों से रहित स्थान न मिल जाए। सुई को गर्भाशय की दीवार पर रखें और गर्भाशय जर्दी थैली के माध्यम से सुई को छेदें, और एमनियोटिक थैली किसी भी भ्रूण ऊतक में प्रवेश नहीं कर रही है। फिर वांछित सामग्री की उचित मात्रा इंजेक्ट करें।इंजेक्शन के किसी भी प्रकार के बाद, इंजेक्शन साइट से सुई वापस लेने के एक बार वांछित मात्रा दिया जाता है । और अगले भ्रूण के लिए आगे बढ़ना जब तक सही गर्भाशय सींग के भ्रूण के सभी इंजेक्शन दिया गया है । इसके बाद पेट में सही गर्भाशय का सींग वापस कर दें।और बाएं गर्भाशय के सींग को पेट से बाहर निकाल दें। जब बाएं सींग में सभी भ्रूण इंजेक्शन दिया गया है पेट को पूरे गर्भाशय वापस, एक गर्भाशय या आंतों volvulus से बचने के लिए ध्यान रखते हुए। किसी भी अविवेकी नुकसान को बदलने के लिए पेट में बाँझ पीबीएस के लगभग दो मिलीलीटर बांटने के लिए एक डिस्पोजेबल ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें।और एक सतत परत में प्रावरणी और पेट को बंद करने के लिए 4-0 पॉलीग्लेक्टिन 910 टांके का उपयोग करें। फिर माउस को पूर्ण भार शक्ति तक निगरानी के साथ एक गर्मी दीपक के नीचे एक साफ पिंजरे में स्थानांतरित करें। इस प्रशिक्षण प्रयोग में भ्रूण है कि एक प्रशिक्षु द्वारा में-utero प्रत्यारोपण प्राप्त के यकृत इंजेक्शन के बाद 24 घंटे कम फ्लोरोसेंट स्तर प्रदर्शित, प्रत्यारोपित GFP कोशिकाओं की एक कम engraftment के कारण, से एक अनुभवी प्रशिक्षक द्वारा इंजेक्शन यकृत किया था ।जीएफपी पॉजिटिव डोनर कोशिकाओं के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत मनाए गए फ्लोरोसेंट के निचले स्तर के साथ भी सहसंबद्ध है। एमनियोटिक द्रव के संपर्क में कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए इंट्रा-एमनियोटिक मार्ग के माध्यम से वितरित वायरल वैक्टर की क्षमता। एपिथेलियल कोशिकाओं के संकुचन द्वारा उदाहरण के लिए ४८ घंटे एडेनो वायरस के गर्भाशय इंजेक्शन में गर्भावधि दिन १२.५ भ्रूण में GFP ट्रांसजीन ले जाने के बाद उदाहरण है ।एक बार इस तकनीक में महारत हासिल करने के बाद प्रति गर्भवती माउस 15-25 मिनट में पूरा कर सकते हैं। इस वीडियो को देखने के बाद आपको माउस भ्रूण को विभिन्न उपचारों को सुरक्षित और प्रभावी ढंग से वितरित करने के तरीके की अच्छी समझ होनी चाहिए।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

इवांस नीले रंग की डाई के साथ zebrafish लार्वा कंकाल की मांसपेशी वफ़ादारी का विश्लेषण

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

में सक्रिय ERK के स्थानिक और लौकिक विश्लेषण<em&gt; सी। एलिगेंस</em&gt; जर्मलाइन

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Murine भ्रूण Metatarsals की संस्कृति: endochondral हड्डी बन जाना के एक शारीरिक मॉडल

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

संवहनी एंडोथिलियल स्टेम सेल के पोत जनरेशन को विज़ुअलाइज़ करने के लिए एक उपन्यास स्तनधारी फैट पैड ट्रांसप्लांटेशन तकनीक

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

वयस्क Drosophila melanogaster दिमाग में मशरूम शरीर और Photoreceptor न्यूरॉन्स के विच्छेदन और Immunofluorescent धुंधला

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

RNAi और हीट शॉक-प्रेरित प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति के आवेदन के लिए सी. एलिगेंस में न्यूरॉन्स के लिए रोगाणु कोशिकाओं reprogram

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

सेल एकत्रीकरण परख सीआईएसद्वारा ट्रांस-लाइगैंडों और उसके निषेध के साथ Drosophila पायदान के बंधन का मूल्यांकन करने के लिए-लाइगैंडों

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Utero Electroporation में प्रयोग अनुमस्तिष्क दाना कोशिकाओं में समारोह विश्लेषण के CRISPR-मध्यस्थता हानि-आधारित जीन स्थानांतरण

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Gastrulating माउस में नोड और Notochordal प्लेट visualizing इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर भ्रूण

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...