Name: intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model
Uploaded: 2018-10-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model at JoVE.com

I protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato di uso presso The Children Hospital di Philadelphia e istituzionali Animal Care.
1. creazione delle pipette di iniezione
<ol><li>Utilizzando un estrattore micropipetta verticale, tirare una pipetta di microcapillary 100 µ l (Figura 1A - 1C). Calibrare la levetta della micropipetta in modo che la parte conica è > 1 cm di lunghezza. Nota: Inizialmente, le impostazioni dell'estrattore...

<ol>
	<li>Loukogeorgakis, S., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+stem+cell+and+gene+therapy:+current+status+and+future+perspectives.">In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives.</a> European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).</li><li>Vrecenak, J., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+hematopoietic+cell+transplantation:+recent+progress+and+the+potential+for+clinical+application.">In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application.</a> Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+murine+hemoglobinopathies+by+prenatal+tolerance+induction+and+postnatal+nonmyeloablative+allogeneic+BM+transplants.">Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants.</a> Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).</li><li>Vrecenak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Long-Term+Mixed+Chimerism+Achieved+in+a+Canine+Model+of+Allogeneic+in+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD26+Inhibition+Enhances+Allogeneic+Donor-Cell+Homing+and+Engraftment+after+in+utero+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).</li><li>Waddington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+gene+transfer+of+human+factor+IX+to+fetal+mice+can+induce+postnatal+tolerance+of+the+exogenous+clotting+factor.">In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor.</a> Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).</li><li>Stitelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Stage+Determines+Efficiency+of+Gene+Transfer+to+Muscle+Satellite+Cells+by+in+utero+Delivery+of+Adeno-Associated+Virus+Vector+Serotype+2/9.">Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 1, 14040 (2014).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Transfer+to+Ocular+Stem+Cells+by+Early+Gestational+Intraamniotic+Injection+of+Lentiviral+Vector.">Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector.</a> Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).</li><li>Boelig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intravenous+Route+of+Injection+Optimizes+Engraftment+and+Survival+in+the+Murine+Model+of+In+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-amniotic+Transient+Transduction+of+the+Periderm+with+a+Viral+Vector+Encoding+TGF&#946;3+Prevents+Cleft+Palate+in+Tgf&#946;3-/-.+Mouse+Embryos.">Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGF&#946;3 Prevents Cleft Palate in Tgf&#946;3-/-. Mouse Embryos.</a> Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).</li><li>Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+gestational+gene+transfer+of+IL-10+by+systemic+administration+of+lentiviral+vector+can+prevent+arthritis+in+a+murine+model.">Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model.</a> Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).</li><li>Reay, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-Length+Dystrophin+Gene+Transfer+to+the+Mdx+Mouse+in+utero.">Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero.</a> Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).</li><li>Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Mor&#225;n, M., Y&#225;&#241;ez-Mu&#241;oz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Transduction+of+Spinal+Cord+Motor+Neurons+by+Intrauterine+Delivery+of+Integration-Deficient+Lentiviral+Vectors.">High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors.</a> Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).</li><li>Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Brain-Directed+AAV+Gene+Therapy+Results+in+Rapid,+Robust,+and+Persistent+Transduction+of+Mouse+Choroid+Plexus+Epithelia.">Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).</li><li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+in+utero+transplantation.">A mouse model of in utero transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).</li><li>Davey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaagsiekte+Sheep+Retrovirus+Pseudotyped+Lentiviral+Vector-Mediated+Gene+Transfer+to+Fetal+Ovine+Lung.">Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung.</a> Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).</li></ol>

Il trapianto in utero è una potenziale terapia per molte patologie congenite che possono essere diagnosticate presto nella gestazione. Il modello murino per IUT permette ai ricercatori di esplorare l'ambiente fetale o di sperimentare con diverse terapie. A seconda di ciò che è stato iniettato e che cosa è presi di mira, per via endovenosa o intra-amniotic nell'utero trapianto può fornire una consegna affidabile di un injectant nello spazio desiderato.
Quando la destinazi...

Recenti progressi nella diagnosi e lo screening prenatale hanno portato alla luce la possibilità di trattare il feto per un certo numero di disordini congeniti che non hanno opzioni di adeguato trattamento postnatale e provocare la morbosità e mortalità significative. In particolare, nell'utero il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (IUHCT) e la modifica di gene terapia/genoma hanno il potenziale per approfittare delle proprietà inerente allo sviluppo normale del feto per trattare congenita ematologica, sistema immunitario e genetico i disordini più efficientemente postnatale trapianto di HSC e gene terapia/genoma modifica può fare1,2. In particolare, a causa delle piccole dimensioni del feto, la cellula donatrice o dose di vettore virale può essere ingrandita per il peso del destinatario. Inoltre, l'immaturità immunologica del feto consente donatore HSCs per essere iniettato senza il mieloablativa e immunosoppressiva condizionata che è necessaria in protocolli di trapianto postnatale. Allo stesso modo, vettori virali che trasportano un transgene terapeutico o la tecnologia di editing del genoma possono essere iniettati senza una risposta immunitaria limitante per il prodotto di transgene o il vettore virale. Infine, l'accessibilità e la natura proliferativa delle cellule embrionali staminali/progenitrici diano la possibilità di un più efficiente trasduzione delle cellule del progenitor di destinazione, nonché taluni modi di genoma editing (regia di omologia riparazione) che richiedono ciclismo cellule si verificano in modo efficiente. Il modello murino serve come un mezzo penetrante e conveniente per affrontare questioni importanti in biologia delle cellule staminali e immunologia prima della sperimentazione in modelli pre-clinici di animali grandi e, come tale, ha servito come il modello primario in cui IUHCT e nell'utero terapia genica sono stati esplorati1,2,3.
Anche se molte variabili svolgono un ruolo importante nel successo di IUHCT e nell'utero gene editing terapia/genomico in modelli murini e grandi animali, una variabile fondamentale è il metodo di consegna del vettore virale o HSCs. La consegna di grandi dosi di donatore HSCs con un effetto di primo passaggio che si verificano nel fegato fetale, l'organo ematopoietico al momento della IUHCT, ha dimostrata di essere determinante nel raggiungimento di livelli macrochimeric di attecchimento in mouse e modelli animali di grandi dimensioni4 ,5. Questo è stato raggiunto tramite un'iniezione di donatore cellule tramite la vena vitellina nel modello del topo e tramite un'iniezione intra-cardiaca nel modello canino. Il percorso di iniezione anche gioca un ruolo fondamentale nell'ottimizzazione del progenitor di diversi organi durante lo sviluppo. Ad esempio, un'iniezione endovenosa tramite la vena vitellina ha dimostrata in modo efficiente trasduce cardiomyocytes ed epatociti segue un fine gestazione iniezione6,7. In alternativa, un'iniezione intra-amniotic dei vettori virali permette il targeting degli organi che sono fisicamente esposti basati su pieghevole/sviluppo embrionale al momento dell' iniezione8. Questo è meglio esemplificato dal targeting di epitelio respiratorio tramite un'iniezione intra-amniotic nel tardo la gestazione per approfittare dei normali movimenti fetali "respirazione", che espone le vie respiratorie per il vettore virale nell'amniotico fluido9. Queste due modalità di IUT, per via endovenosa tramite la vena vitellina e intra-amniotic, sono state la base per esperimenti multipli passate e in corso nel nostro laboratorio. In questo protocollo, descriviamo dettagliatamente le modalità di esecuzione per via endovenosa e intra-amniotic IUT nel modello murino.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Gloves</td>
			<td style="width:168px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:147px;">2D73DP65</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/ teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/o teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14075-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heavy Scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14002-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Needle Driver</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">12005-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vicryl 2.0</td>
			<td style="width:168px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">JB945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Transfer Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">GSI135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">MDS202000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">50 mL Conical tube</td>
			<td style="width:168px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Tape</td>
			<td style="width:168px;">3M</td>
			<td style="width:147px;">1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Eye lubricant</td>
			<td style="width:168px;">Major LubriFresh</td>
			<td style="width:147px;">0904-6488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:168px;">K&#38;H</td>
			<td style="width:147px;">3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:168px;">Leica</td>
			<td style="width:147px;">MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Injector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">HI01PK01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Glass Capillary tubes</td>
			<td style="width:168px;">Kimble</td>
			<td style="width:147px;">71900-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vertical Micropipette Puller</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Microelectrode Beveler</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">IM-300 Pneumatic Microinjector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">IM-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Insulin Syringe&#160;</td>
			<td style="width:168px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:147px;">305935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Filter</td>
			<td style="width:168px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:147px;">25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Compac5 Anesthesia Machine</td>
			<td style="width:168px;">VetEquip Compac5</td>
			<td style="width:147px;">901812&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:168px;">Piramal Critical Care</td>
			<td style="width:147px;">NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">N2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">NI 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">O2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">OX 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Ad-GFP viral vector</td>
			<td style="width:168px;">Penn Vector Core</td>
			<td style="width:147px;">H5&#39;.040.CMV.eGFP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model

Il trapianto in utero (IUT) è un modo unico e versatile di terapia che può essere utilizzato per introdurre le cellule staminali, vettori virali o altre sostanze all'inizio della gestazione. La spiegazione razionale dietro IUT a scopo terapeutico è basata sulle piccole dimensioni del feto, l'immaturità fetale immunologica, l'accessibilità e la natura proliferativa delle cellule staminali o progenitrici fetale e il potenziale di trattare una malattia o l'insorgenza di sintomi prima della nascita. Approfittando di queste proprietà inerente allo sviluppo normale del feto, la fornitura di cellule staminali ematopoietiche (HSC) tramite un IUT ha il potenziale per il trattamento di disordini congeniti ematologici quali anemia falciforme, senza la necessaria i trapianti mieloablativa o immunosoppressiva condizionata necessaria per HSC postnatale. Allo stesso modo, l'accessibilità delle cellule progenitrici in organi multipli durante lo sviluppo potenzialmente permette per un targeting più efficiente delle cellule staminali/progenitrici dopo un IUT di vettori virali per la terapia genica o editing genomico. Inoltre, IUT può essere usato per studiare i processi inerenti allo sviluppo normali tra cui, ma non limitato a, lo sviluppo di tolleranza immunologica. Il modello murino fornisce un mezzo prezioso e conveniente per comprendere le potenzialità e le limitazioni di IUT prima studi pre-clinici di animali grandi e un'eventuale applicazione clinica. Qui, descriviamo un protocollo per l'esecuzione di un IUT nel feto murino attraverso vie endovenosa e intra-amniotic. Questo protocollo è stato usato con successo per delucidare i meccanismi dietro nell'utero il trapianto di cellule staminali ematopoietiche, induzione della tolleranza e la terapia genica nell'utero e le condizioni necessarie.

Sopravvivenza e attecchimento sono misure importanti di successo per gli esperimenti IUHCT. A seconda degli specifici endpoint di un esperimento, i feti che ha ricevuto un IUHCT possono essere analizzati prenatally con un taglio cesareo o dopo la nascita. In media, i tassi di sopravvivenza dopo iniezioni endovenose vanno da 75-100%. I tassi di sopravvivenza dopo le iniezioni intra-amniotic tendono a Fiera meglio di iniezioni endovenose, a circa 85-100%.
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Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Endovenosa e Intra-amniotic nell'Utero trapianto nel modello murino

Descriviamo un protocollo per l'esecuzione di un trapianto in utero (IUT) attraverso vie endovenosa e intra-amniotic di iniezione nel modello murino. Questo protocollo consente di introdurre cellule, vettori virali e altre sostanze nell'unico ambiente fetale immunitario-tollerante.

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in embriologia, terapia genica e trapianto di cellule staminali. Un vantaggio di questa tecnica è che consente l'analisi degli effetti delle diverse terapie sperimentali sui feti murini. A dimostrare questa procedura saranno i medici Nicholas Ahn e Barbara Coons, medici e ricercatori del nostro laboratorio.Prima di iniziare la procedura, far cadere da cinque a 10 microlitri di PBS sterile in e fuori dalla punta dell'ago chirurgico, da due a tre volte per liberarlo da eventuali detriti. Quindi riempire l'ago con il reagente di interesse al volume sperimentale e alla concentrazione appropriati. E premere il pulsante di modalità tre volte sul micro iniettore per passare alla schermata di calibrazione dell'iniezione.Aggiungere intervalli di 10 o 100 millisecondi per regolare il tempo di iniezione e premere il pulsante modalità altre due volte. Premere il pulsante di bilanciamento e premere il pedale una volta. Quindi premere di nuovo il pedale e valutare quale volume di soluzione viene svuotato dall'ago per spinta.Quando il micro iniettore è calibrato al volume sperimentale appropriato, riempire l'ago al livello corretto per l'iniezione. Quando tutti gli aghi sono stati puliti, confermare la mancanza di risposta al pizzico del topo femmina incinta di due o sei mesi. Radere l'addome, facendo attenzione a non danneggiare i capezzoli e trasferire l'animale in una pastiglia riscaldante in posizione supina.Applicare un unguento agli occhi dell'animale e fissare gli arti alla pastiglia riscaldante con del nastro adesivo. E disinfettare la pelle esposta. Quindi iniettare anestetici locali come 100 microlitri dello 0,25% di Bupivacaina per via sottocutanea.Successivamente, fare un'incisione cutanea da uno a due centimetri in modo che il bordo inferiore non sia più vicino di un centimetro all'introito e identificare la linea mediana della fascia, facendo attenzione a non ferire i vasi epigastrici circostanti. Usando le pinza Adson, pizzicare la fascia senza afferrare nessuno degli organi o dei feti sottostanti e aprire il tessuto con le forbici. Una volta in sicurezza all'interno della cavità addominale, estendere l'incisione fasciale alla lunghezza dell'incisione cutanea e utilizzare applicatori a punta di cotone per spostare l'intestino nella parte superiore dell'addome per esporre l'utero gravid.Estrarre l'utero attraverso l'incisione identificando attentamente le ovaie destra e sinistra per assicurarsi che tutti i feti siano contati. Riposizionare l'utero sinistro nell'addome in modo che sia esposto solo l'utero destro, per mantenere caldi i feti non iniettati. E afferrare delicatamente il sacco amniotico più laterale tra il pollice e le dita indice della mano non dominante.Posizionare il microscopio a dissezione sull'animale e regolare la messa a fuoco e l'illuminazione per una migliore visualizzazione del feto, se necessario. Per un'iniezione endovenosa ruotare l'utero in modo che la vitellina vana, da iniettare sia parallela alla punta dell'ago. E posare l'ago sull'utero con un angolo di cinque gradi per perforare il muro uterino.Con la punta tra la parete uterina e il sacco amniotico, posizionare la punta direttamente in cima alla vitellina invano e con un angolo quasi tangenziale, scivolare l'ago sul vano fino a quando la smussatura avanza nel vaso. È imperativo che l'angolo rimanga basso in modo che l'ago non penetri nella parete posteriore del vaso. Quando si osserva una macchia di sangue sulla punta dell'ago, premere il pedale per iniettare l'intero volume del materiale di interesse nel vaso.Per un'iniezione intra amniotica, ruotare il sacco amniotico fino a trovare una posizione priva di vasi. Puntare l'ago perpendicolarmente alla parete uterina e perforare l'ago attraverso il sacco di tuorlo dell'utero e il sacco amniotico facendo attenzione a non penetrare alcun tessuto fetale. Quindi iniettare il volume appropriato di materiale desiderato.Dopo entrambi i tipi di iniezione, ritirare l'ago dal sito di iniezione una volta consegnato il volume desiderato. E procedere al feto successivo fino a quando tutti i feti del corno uterino destro non sono stati iniettati. Quindi riportare il corno uterino destro nell'addome.E rimuovere il corno uterino sinistro dall'addome. Quando tutti i feti nel corno sinistro sono stati iniettati restituire l'intero utero all'addome, facendo attenzione a evitare un volvulo uterino o intestinale. Utilizzare una pipetta di trasferimento usa e getta per erogare circa due millilitri di PBS sterile nell'addome, per sostituire eventuali perdite insensibili.E usa 4-0 suture di poliglatina 910 per chiudere la fascia e l'addome in uno strato continuo. Quindi trasferire il mouse in una gabbia pulita sotto una lampada termica con monitoraggio fino alla piena reclinabilità. In questo esperimento di allenamento i fegati dei feti che hanno ricevuto il trapianto in utero da un tirocinante hanno mostrato livelli fluorescenti più bassi 24 ore dopo l'iniezione, a causa di un maggiore innesto delle cellule GFP trapiantate, rispetto ai fegati iniettati da un istruttore esperto.L'analisi citometrica del flusso per le cellule donatrici positive della GFP è anche correlata con il livello inferiore di fluorescenti osservato sotto microscopia fluorescente. La capacità dei vettori virali consegnati attraverso la via intra-amniotica di trasdurre le cellule a contatto con il fluido amniotico. È esemplificato dalla trasduzione di cellule epiteliali 48 ore dopo l'iniezione in utero del virus Adeno che trasporta il transgene GFP nei feti gestazionali del giorno 12.5.Una volta padroneggiata questa tecnica può essere completata in 15-25 minuti per topo incinta. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come fornire in modo sicuro ed efficace diverse terapie ai feti del topo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Ricerca

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