Name: intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model
Uploaded: 2018-10-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model at JoVE.com

Los protocolos experimentales fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en Hospital de Filadelfia de los niños.
1. creación de pipetas de inyección
<ol><li>Utilizando un extractor de micropipeta vertical, tire de una pipeta 100 μl de microcapillary (figura 1A - 1C). Calibre el extractor de la micropipeta para que el extremo cónico es > 1 cm de largo. Nota: Inicialmente, la configuración del tirador debe ajustarse p...

<ol>
	<li>Loukogeorgakis, S., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+stem+cell+and+gene+therapy:+current+status+and+future+perspectives.">In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives.</a> European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).</li><li>Vrecenak, J., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+hematopoietic+cell+transplantation:+recent+progress+and+the+potential+for+clinical+application.">In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application.</a> Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+murine+hemoglobinopathies+by+prenatal+tolerance+induction+and+postnatal+nonmyeloablative+allogeneic+BM+transplants.">Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants.</a> Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).</li><li>Vrecenak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Long-Term+Mixed+Chimerism+Achieved+in+a+Canine+Model+of+Allogeneic+in+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD26+Inhibition+Enhances+Allogeneic+Donor-Cell+Homing+and+Engraftment+after+in+utero+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).</li><li>Waddington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+gene+transfer+of+human+factor+IX+to+fetal+mice+can+induce+postnatal+tolerance+of+the+exogenous+clotting+factor.">In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor.</a> Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).</li><li>Stitelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Stage+Determines+Efficiency+of+Gene+Transfer+to+Muscle+Satellite+Cells+by+in+utero+Delivery+of+Adeno-Associated+Virus+Vector+Serotype+2/9.">Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 1, 14040 (2014).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Transfer+to+Ocular+Stem+Cells+by+Early+Gestational+Intraamniotic+Injection+of+Lentiviral+Vector.">Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector.</a> Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).</li><li>Boelig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intravenous+Route+of+Injection+Optimizes+Engraftment+and+Survival+in+the+Murine+Model+of+In+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-amniotic+Transient+Transduction+of+the+Periderm+with+a+Viral+Vector+Encoding+TGF&#946;3+Prevents+Cleft+Palate+in+Tgf&#946;3-/-.+Mouse+Embryos.">Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGF&#946;3 Prevents Cleft Palate in Tgf&#946;3-/-. Mouse Embryos.</a> Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).</li><li>Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+gestational+gene+transfer+of+IL-10+by+systemic+administration+of+lentiviral+vector+can+prevent+arthritis+in+a+murine+model.">Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model.</a> Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).</li><li>Reay, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-Length+Dystrophin+Gene+Transfer+to+the+Mdx+Mouse+in+utero.">Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero.</a> Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).</li><li>Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Mor&#225;n, M., Y&#225;&#241;ez-Mu&#241;oz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Transduction+of+Spinal+Cord+Motor+Neurons+by+Intrauterine+Delivery+of+Integration-Deficient+Lentiviral+Vectors.">High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors.</a> Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).</li><li>Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Brain-Directed+AAV+Gene+Therapy+Results+in+Rapid,+Robust,+and+Persistent+Transduction+of+Mouse+Choroid+Plexus+Epithelia.">Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).</li><li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+in+utero+transplantation.">A mouse model of in utero transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).</li><li>Davey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaagsiekte+Sheep+Retrovirus+Pseudotyped+Lentiviral+Vector-Mediated+Gene+Transfer+to+Fetal+Ovine+Lung.">Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung.</a> Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).</li></ol>

En el útero el trasplante es una terapia potencial para muchos trastornos congénitos que se pueden diagnosticar temprano en la gestación. El modelo murino de IUT permite a los investigadores a explorar el entorno fetal o a experimentar con diferentes tratamientos. Dependiendo de lo que es ser inyectado y lo que es blanco, intravenosa o intra-amniótico en el útero el trasplante puede proporcionar una entrega confiable de un injectant en el espacio deseado.
Cuando determin...

Los avances recientes en el diagnóstico y detección prenatal han sacado a la luz la posibilidad de tratar al feto para un número de enfermedades congénitas que no tienen opciones de tratamiento postnatal adecuada y dar lugar a morbosidad significativa y mortalidad. Específicamente, en el útero del trasplante de células madre hematopoyéticas (IUHCT) y gene terapia genoma edición tienen el potencial para tomar ventaja de las propiedades del desarrollo normales del feto para el tratamiento de congénito hematológica, inmunológica y genética trastornos de la forma más eficiente de postnatal trasplante de HSC y gene terapia genoma edición pueden hacer1,2. Específicamente, debido al pequeño tamaño del feto, la célula donante o dosis de vector viral pueden ser maximizado por el peso del recipiente. Además, la inmadurez inmunológica del feto permite donantes HSCs para inyectar sin la myeloablative y acondicionamiento inmunosupresor es necesaria en los protocolos de trasplante postnatal. Del mismo modo, vectores virales llevando un transgen terapéutico o tecnología de edición del genoma se pueden inyectar sin una respuesta inmune limita el producto del transgen o el vector viral. Por último, la accesibilidad y la naturaleza proliferativa de las células progenitoras fetales de permitirse la posibilidad de una más eficiente transducción de células progenitoras de destino, así como ciertos modos de genoma edición (dirigido por homología reparación) que requieren de ciclismo células se producen eficientemente. El modelo murino sirve como un medio profundo y asequible para tratar asuntos importantes en la célula de vástago Biología e Inmunología antes de la experimentación en modelos preclínicos de animal grandes y, como tal, ha servido como el principal modelo en el que IUHCT y en el útero terapia génica han sido explorados1,2,3.
Aunque muchas variables juegan un papel importante en el éxito de IUHCT y en el útero gene terapia genoma edición en modelos animales murinos y grandes, una variable clave es el método de entrega de las HSCs o vector viral. La entrega de grandes dosis de donante HSCs con un efecto de primer paso que ocurre en el hígado fetal, el órgano hematopoyético en el momento de la IUHCT, se ha demostrado para ser instrumental en el logro de niveles de macrochimeric del engraftment en ratón y en modelos animales grandes4 ,5. Esto fue alcanzada a través de una inyección de donantes las células a través de la vena vitelina en el modelo murino y por medio de una inyección intra cardiaca en el modelo canino. La ruta de inyección también juega un papel fundamental en la orientación de las células progenitoras de los diferentes órganos durante el desarrollo. Por ejemplo, una inyección intravenosa a través de la vena vitelina ha demostrado a transducir eficazmente cardiomiocitos y hepatocitos después de una gestación tardía inyección6,7. Alternativamente, la inyección intraamniótica de vectores virales permite la focalización de los órganos que se exponen físicamente basados en el plegado/desarrollo embrionario en el momento de la inyección de8. Esto se ejemplifica mejor en atacar el epitelio respiratorio a través de una inyección intra amniótico a finales de la gestación aprovechando normal movimientos fetales con "respiración", que expone las vías respiratorias al vector viral en el amniótico líquido9. Estos dos modos del IUT, intravenosa a través de la vena vitelina e intraamniótica, han sido la base para múltiples experimentos pasados y actuales en nuestro laboratorio. En este protocolo, se describen en detalle los métodos para realizar intravenosa e intraamniótica IUT en el modelo murino.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Gloves</td>
			<td style="width:168px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:147px;">2D73DP65</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/ teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/o teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14075-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heavy Scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14002-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Needle Driver</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">12005-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vicryl 2.0</td>
			<td style="width:168px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">JB945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Transfer Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">GSI135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">MDS202000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">50 mL Conical tube</td>
			<td style="width:168px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Tape</td>
			<td style="width:168px;">3M</td>
			<td style="width:147px;">1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Eye lubricant</td>
			<td style="width:168px;">Major LubriFresh</td>
			<td style="width:147px;">0904-6488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:168px;">K&#38;H</td>
			<td style="width:147px;">3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:168px;">Leica</td>
			<td style="width:147px;">MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Injector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">HI01PK01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Glass Capillary tubes</td>
			<td style="width:168px;">Kimble</td>
			<td style="width:147px;">71900-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vertical Micropipette Puller</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Microelectrode Beveler</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">IM-300 Pneumatic Microinjector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">IM-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Insulin Syringe&#160;</td>
			<td style="width:168px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:147px;">305935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Filter</td>
			<td style="width:168px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:147px;">25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Compac5 Anesthesia Machine</td>
			<td style="width:168px;">VetEquip Compac5</td>
			<td style="width:147px;">901812&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:168px;">Piramal Critical Care</td>
			<td style="width:147px;">NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">N2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">NI 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">O2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">OX 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Ad-GFP viral vector</td>
			<td style="width:168px;">Penn Vector Core</td>
			<td style="width:147px;">H5&#39;.040.CMV.eGFP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model

En el útero (IUT) es un modo de tratamiento que puede utilizarse para introducir las células madre, vectores virales u otras substancias temprano en la gestación único y versátil. El fundamento IUT para fines terapéuticos se basa en el pequeño tamaño del feto, la inmadurez inmunológica fetal, la accesibilidad y la naturaleza proliferativa de las células madre o progenitoras fetales y el potencial para tratar una enfermedad o la aparición de síntomas antes del nacimiento. Aprovechando estas características del desarrollo normales del feto, la entrega de las células madre hematopoyéticas (HSC) vía un IUT tiene el potencial para el tratamiento de trastornos hematológicos congénitos como enfermedad de células falciformes, sin la necesaria trasplantes de myeloablative o inmunosupresor acondicionado para HSC postnatal. Asimismo, la accesibilidad de células progenitoras en múltiples órganos durante el desarrollo potencialmente permite una selección más eficiente de células madre/progenitoras después un IUT de vectores virales para terapia génica o la edición del genoma. Además, IUT puede ser utilizado para estudiar los procesos del desarrollo normales incluyendo, pero no limitado a, el desarrollo de tolerancia inmunológica. El modelo murino proporciona un medio valioso y asequible a la comprensión de las potencialidades y limitaciones del IUT antes de los grandes estudios en animales y una eventual aplicación clínica. Aquí, describimos un protocolo para realizar un IUT en el feto murino por vías intravenosa e intraamniótica. Este protocolo se ha utilizado con éxito para aclarar las condiciones necesarias y los mecanismos detrás de en el útero el trasplante de células madre hematopoyéticas, inducción de la tolerancia y en el útero la terapia génica.

Supervivencia y el engraftment son medidas importantes de éxito para los experimentos IUHCT. Dependiendo de los extremos específicos de un experimento, fetos que recibieron un IUHCT pueden analizarse prenatally por una cesárea o postnatal. En promedio, las tasas de supervivencia después de inyecciones intravenosas entre 75-100%. Las tasas de supervivencia después de inyecciones intraamniótica tienden a Feria mejor que las inyecciones intravenosas, alrededor del 85-100%.
<p class...

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Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenosa y Intra-amniótico en el útero el trasplante en el modelo murino

Se describe un protocolo para realizar un trasplante en el útero (IUT) a través de rutas intravenosa e intraamniótica de inyección en el modelo murino. Este protocolo puede utilizarse para introducir las células, vectores virales y otras sustancias en el ambiente fetal inmune tolerante único.

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en embriología, terapia génica y trasplante de células madre. Una ventaja de esta técnica es que permite el análisis de los efectos de diferentes terapias experimentales en fetos murinos. Demostrando este procedimiento serán los doctores Nicholas Ahn, y Barbara Coons, médicos y compañeros de investigación en nuestro laboratorio.Antes de comenzar el procedimiento, deje caer de cinco a 10 microlitros de PBS estéril dentro y fuera de la punta quirúrgica de la aguja, de dos a tres veces para eliminar cualquier posible escombro. A continuación, llene la aguja con el reactivo de interés en el volumen experimental y la concentración adecuados. Y pulse el botón de modo tres veces en el microinyector para avanzar a la pantalla de calibración de la inyección.Agregue intervalos de 10 o 100 milisegundos para ajustar el tiempo de inyección y pulse el botón de modo dos veces más. Pulse el botón de equilibrio y presione el pedal una vez. A continuación, presione el pedal de nuevo y evalúe qué volumen de solución se vacía fuera de la aguja por empuje.Cuando el microinyector esté calibrado al volumen experimental adecuado, llene la aguja al nivel correcto para la inyección. Cuando se hayan limpiado todas las agujas, confirme la falta de respuesta a la pellizca del ratón hembra embarazada de dos a seis meses de edad. Afeitar el abdomen, teniendo cuidado de no dañar los pezones, y transferir el animal a una almohadilla de calentamiento en la posición supina.Aplique un ung ón en los ojos del animal y fije las extremidades a la almohadilla de calentamiento con cinta adhesiva. Y desinfectar la piel expuesta. A continuación, inyectar anestésicos locales como 100 microlitros de 0.25%Bupivacaína por vía subcutánea.A continuación, haga una incisión cutánea de uno a dos centímetros de manera que el borde inferior no esté más cerca de un centímetro del introito, e identifique la línea media de la fascia, teniendo cuidado de no lesionar los vasos epigátricos circundantes. Usando fórceps Adson, pellizca la fascia sin agarrar ninguno de los órganos o fetos subyacentes, y abre el tejido con tijeras. Una vez que se encuentra de forma segura dentro de la cavidad abdominal, extienda la incisión fascial a lo largo de la incisión cutánea y utilice aplicadores de punta de algodón para mover los intestinos hacia la parte superior del abdomen para exponer el útero gravid.Extraiga el útero a través de la incisión identificando cuidadosamente los ovarios derecho e izquierdo para asegurarse de que se cuentan todos los fetos. Coloque el útero izquierdo de nuevo en el abdomen para que sólo el útero derecho esté expuesto, para mantener calientes los fetos no inyectados. Y agarra suavemente el saco amniótico más lateral entre el pulgar y los dedos índice de la mano no dominante.Coloque el microscopio de disección sobre el animal y ajuste el enfoque y la iluminación para una mejor visualización del feto según sea necesario. Para una inyección intravenosa gire el útero de modo que la vitellina vana, que se va a inyectar sea paralela a la punta de la aguja. Y poner la aguja en el útero en un ángulo de cinco grados para perforar la pared uterina.Con la punta entre la pared uterina y el saco amniótico, coloque la punta directamente sobre la vitellina vano y en un ángulo casi tangencial, deslice la aguja sobre el vano hasta que el bisel avance en el recipiente. Es imperativo que el ángulo permanezca bajo para que la aguja no penetre en la pared posterior del recipiente. Cuando se observa una mancha de sangre en la punta de la aguja, para presionar el pedal para inyectar el volumen completo del material de interés en el vaso.Para una inyección intra amniótica, gire el saco amniótico hasta que se encuentre un lugar desprovisto de vasos. Apunte la aguja perpendicular a la pared uterina y perfore la aguja a través del saco de yema del útero, y el saco amniótico teniendo cuidado de no penetrar ningún tejido fetal. A continuación, inyecte el volumen adecuado de material deseado.Después de cualquier tipo de inyección, retire la aguja del lugar de inyección una vez que se entregue el volumen deseado. Y proceda al siguiente feto hasta que se hayan inyectado todos los fetos del cuerno uterino derecho. Luego devuelve el cuerno uterino derecho al abdomen.Y retire el cuerno uterino izquierdo del abdomen. Cuando se han inyectado todos los fetos en el cuerno izquierdo, devolver todo el útero al abdomen, teniendo cuidado de evitar un vólvulo uterino o intestinal. Utilice una pipeta de transferencia desechable para dispensar alrededor de dos mililitros de PBS estéril en el abdomen, para reemplazar cualquier pérdida insensible.Y usa 4-0 poliglactin 910 suturas para cerrar la fascia y el abdomen en una capa continua. A continuación, transfiera el ratón a una jaula limpia bajo una lámpara de calor con supervisión hasta la recumbencia completa. En este experimento de entrenamiento, los hígados de los fetos que recibieron trasplantes en el útero por un aprendiz mostraron niveles fluorescentes más bajos 24 horas después de la inyección, debido a un menor enjerto de las células GFP trasplantadas, que los hígados inyectados por un instructor experimentado.El análisis citométrico de flujo para células de donantes positivos de GFP también se correlacionó con el nivel inferior de fluorescentes observado bajo microscopía fluorescente. La capacidad de los vectores virales entregados a través de la vía intra-amniótica a las células transducidas en contacto con el líquido amniótico. Se ejemplifica por la transducción de células epiteliales 48 horas después de la inyección en utero del virus Deno portador del transgén GFP en fetos gestacionales del día 12.5.Una vez dominada esta técnica puede completarse en 15-25 minutos por ratón embarazada. Después de ver este video usted debe tener una buena comprensión de cómo entregar de forma segura y eficaz diferentes terapias a los fetos de ratón.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Análisis espacial y temporal de ERK en el Activo<em&gt; C. elegans</em&gt; línea germinal

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Cultura de murinos embrionarias Metatarsianos: Un modelo fisiológico de osificación endocondral

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria para visualizar la generación de vasos de células madre endoteliales vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Célula de ensayos de agregación para evaluar el atascamiento de la muesca de Drosophila con Trans-ligandos y su inhibición por Cis-ligandos

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Mediada por CRISPR pérdida de función análisis en gránulo cerebeloso células usando en el útero electroporación basado en la transferencia de genes

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Evaluación de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales después en la transducción de útero de cerebro de ratón en desarrollo y a la médula espinal

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...