Name: intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model
Uploaded: 2018-10-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model at JoVE.com

De experimentella protokoll godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén på The Children's Hospital i Philadelphia.
1. skapande av injektion pipetter
<ol><li>Med hjälp av vertikala mikropipett avdragare, dra 100 µL microcapillary pipett (figur 1A - 1 C). Kalibrera den mikropipett avdragare så att den spetsiga änden är > 1 cm lång. Obs: Initialt, inställningarna för avdragare bör justeras för en optimal längd...

<ol>
	<li>Loukogeorgakis, S., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+stem+cell+and+gene+therapy:+current+status+and+future+perspectives.">In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives.</a> European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).</li><li>Vrecenak, J., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+hematopoietic+cell+transplantation:+recent+progress+and+the+potential+for+clinical+application.">In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application.</a> Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+murine+hemoglobinopathies+by+prenatal+tolerance+induction+and+postnatal+nonmyeloablative+allogeneic+BM+transplants.">Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants.</a> Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).</li><li>Vrecenak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Long-Term+Mixed+Chimerism+Achieved+in+a+Canine+Model+of+Allogeneic+in+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD26+Inhibition+Enhances+Allogeneic+Donor-Cell+Homing+and+Engraftment+after+in+utero+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).</li><li>Waddington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+gene+transfer+of+human+factor+IX+to+fetal+mice+can+induce+postnatal+tolerance+of+the+exogenous+clotting+factor.">In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor.</a> Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).</li><li>Stitelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Stage+Determines+Efficiency+of+Gene+Transfer+to+Muscle+Satellite+Cells+by+in+utero+Delivery+of+Adeno-Associated+Virus+Vector+Serotype+2/9.">Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 1, 14040 (2014).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Transfer+to+Ocular+Stem+Cells+by+Early+Gestational+Intraamniotic+Injection+of+Lentiviral+Vector.">Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector.</a> Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).</li><li>Boelig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intravenous+Route+of+Injection+Optimizes+Engraftment+and+Survival+in+the+Murine+Model+of+In+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-amniotic+Transient+Transduction+of+the+Periderm+with+a+Viral+Vector+Encoding+TGF&#946;3+Prevents+Cleft+Palate+in+Tgf&#946;3-/-.+Mouse+Embryos.">Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGF&#946;3 Prevents Cleft Palate in Tgf&#946;3-/-. Mouse Embryos.</a> Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).</li><li>Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+gestational+gene+transfer+of+IL-10+by+systemic+administration+of+lentiviral+vector+can+prevent+arthritis+in+a+murine+model.">Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model.</a> Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).</li><li>Reay, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-Length+Dystrophin+Gene+Transfer+to+the+Mdx+Mouse+in+utero.">Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero.</a> Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).</li><li>Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Mor&#225;n, M., Y&#225;&#241;ez-Mu&#241;oz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Transduction+of+Spinal+Cord+Motor+Neurons+by+Intrauterine+Delivery+of+Integration-Deficient+Lentiviral+Vectors.">High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors.</a> Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).</li><li>Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Brain-Directed+AAV+Gene+Therapy+Results+in+Rapid,+Robust,+and+Persistent+Transduction+of+Mouse+Choroid+Plexus+Epithelia.">Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).</li><li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+in+utero+transplantation.">A mouse model of in utero transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).</li><li>Davey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaagsiekte+Sheep+Retrovirus+Pseudotyped+Lentiviral+Vector-Mediated+Gene+Transfer+to+Fetal+Ovine+Lung.">Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung.</a> Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).</li></ol>

In utero transplantation är en potentiell behandling för många medfödda sjukdomar som kan diagnostiseras tidigt i dräktigheten. Murina modellen för IUT tillåter forskare att undersöka fostrets miljön eller för att experimentera med olika terapier. Beroende på vad som injiceras och vad är riktade, kan intravenös eller intra-fostervatten i livmodern transplantation ge en tillförlitlig leverans av en injectant in i önskat utrymme.
När rikta specifika organ, är d...

Senaste framstegen inom prenatal screening och diagnos har visat att möjligheten att behandla fostret för ett antal medfödda störningar som inte har adekvat postnatal behandlingsalternativ och leda till betydande sjuklighet och dödlighet. I synnerhet har i livmodern hematopoetisk stamcellstransplantation (IUHCT) och gene therapy/gen editering potential att dra nytta av normala utvecklingsmässiga egenskaper av fostret att behandla medfödda hematologiska, immun och genetiska sjukdomar mer effektivt än postnatal HSC transplantation och gene therapy/gen editering kan göra1,2. Specifikt på grund av den lilla storleken på fostret, kan givare cellen eller virala vektorn dos maximeras per vikt av mottagaren. Dessutom tillåter den immunologiska omognad av fostret givare Förenta injiceras utan myeloablativ och immunsuppressiva luftkonditionering som krävs i postnatal transplantation protokoll. Likaså kan virala vektorer bära en terapeutisk transgenens eller genomet redigering teknik injiceras utan ett begränsande immunsvar mot antingen transgenens produkt eller virala vektorn. Slutligen, tillgänglighet och proliferativ naturen av fetala stamceller/stamceller ger möjlighet att en effektivare transduktion av målet stamceller, liksom vissa lägen av genomet redigering (homologi-regisserad reparation) som kräver Cykling celler förekommer effektivt. Murina modellen fungerar som ett insiktsfulla och prisvärt sätt att ta itu med viktiga frågor i stamcellsbiologi och immunologi före experimentera i prekliniska stora djurmodeller och, som sådan, har fungerat som den primära modellen där IUHCT och i livmodern genterapi har varit utforskade1,2,3.
Även om många variabler har en viktig roll i framgången för IUHCT och i utero gen terapi/gen editering i murina och stora djurmodeller, är en nyckelvariabel metoden för leverans av Förenta eller virala vektorn. Leverans av stora doser av givare Förenta med en första-passage-effekten uppstår i fetala levern, hematopoetiska orgeln vid tidpunkten för IUHCT, har visat sig vara avgörande för att nå macrochimeric nivåer av engraftment mus och stora djurmodeller4 ,5. Detta var uppnås via en injektion av givare celler via den vitelline ven i musmodell och via en intra cardiac injektion i Hundarnas modellen. Sträckningen av injektion också spelar en grundläggande roll i inriktning stamceller av olika organ under utveckling. Exempelvis en intravenös injektion via den vitelline ven har visat sig effektivt transduce hjärtmuskelceller och hepatocyter efter en sen dräktighet injektion6,7. Alternativt kan en intra-fostervatten injektion av virala vektorer inriktningen av organ som utsätts fysiskt baserat på den fällbara/fosterutvecklingen vid tidpunkten för injektion8. Detta exemplifieras bäst av inriktningen av respiratoriskt epitel via en intra-fostervatten injektion sent i dräktigheten att dra nytta av normala foster ”andas” rörelser, som exponerar luftvägarna till virala vektorn i den fostervatten flytande9. Dessa två lägen av IUT, intravenös via den vitelline ven och intra-fostervatten, har legat till grund för flera tidigare och pågående experiment i vårt laboratorium. I detta protokoll beskriver vi i detalj metoderna för att utföra intravenös och intra-fostervatten IUT i murina modellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Gloves</td>
			<td style="width:168px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:147px;">2D73DP65</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/ teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/o teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14075-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heavy Scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14002-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Needle Driver</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">12005-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vicryl 2.0</td>
			<td style="width:168px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">JB945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Transfer Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">GSI135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">MDS202000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">50 mL Conical tube</td>
			<td style="width:168px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Tape</td>
			<td style="width:168px;">3M</td>
			<td style="width:147px;">1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Eye lubricant</td>
			<td style="width:168px;">Major LubriFresh</td>
			<td style="width:147px;">0904-6488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:168px;">K&#38;H</td>
			<td style="width:147px;">3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:168px;">Leica</td>
			<td style="width:147px;">MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Injector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">HI01PK01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Glass Capillary tubes</td>
			<td style="width:168px;">Kimble</td>
			<td style="width:147px;">71900-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vertical Micropipette Puller</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Microelectrode Beveler</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">IM-300 Pneumatic Microinjector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">IM-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Insulin Syringe&#160;</td>
			<td style="width:168px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:147px;">305935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Filter</td>
			<td style="width:168px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:147px;">25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Compac5 Anesthesia Machine</td>
			<td style="width:168px;">VetEquip Compac5</td>
			<td style="width:147px;">901812&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:168px;">Piramal Critical Care</td>
			<td style="width:147px;">NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">N2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">NI 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">O2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">OX 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Ad-GFP viral vector</td>
			<td style="width:168px;">Penn Vector Core</td>
			<td style="width:147px;">H5&#39;.040.CMV.eGFP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model

In utero transplantation (IUT) är en unik och mångsidig läge av terapi som kan användas för att införa stamceller, virala vektorer eller andra ämnen i början av dräktigheten. Logiken bakom IUT för terapeutiska ändamål är baserad på den lilla storleken på fostret, den fetala immunologisk omognad, tillgänglighet och proliferativ naturen av de fetala stamceller eller stamceller cellerna och potential att behandla en sjukdom eller symtomen före födseln. Dra nytta av dessa normala utvecklingsmässiga egenskaper av fostret, leverans av hematopoetiska stamceller (HSC) via en IUT har potential att behandla medfödda hematologiska störningar såsom sicklecellsjukdom, utan det krävs myeloablativ eller immunsuppressiva luftkonditionering krävs för postnatal HSC transplantationer. Likaså kan tillgängligheten av stamceller i flera organ under utveckling potentiellt för en mer effektiv inriktning av stammen/stamceller efter en IUT av virala vektorer för genterapi eller gen editering. Dessutom kan IUT användas att studera normala utvecklingsprocesser inklusive, men inte begränsat till, utveckling av immunologisk tolerans. Murina modellen ger en värdefull och prisvärd möjlighet att förstå möjligheter och begränsningar av IUT före prekliniska studier på stora djur och en eventuell klinisk tillämpning. Här beskriver vi ett protokoll för att utföra en IUT i murina fostret genom intravenös och intra-fostervatten vägar. Detta protokoll har använts framgångsrikt att klarlägga nödvändiga villkor och mekanismer bakom Utero hematopoetisk stamcellstransplantation, toleransutveckling och Utero genterapi.

Överlevnad och engraftment är viktiga mått på framgång för IUHCT experiment. Beroende på specifika ändpunkterna av ett experiment, kan foster som fått ett IUHCT analyseras prenatalt genom ett kejsarsnitt eller postnatalt. Överlevnaden efter intravenösa injektioner alltifrån i genomsnitt 75-100%. Överlevnaden efter intra-fostervatten injektioner tenderar att rättvis bättre än intravenösa injektioner, ca 85-100%.
...

Watch this Scientific Journal Video about Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model at JoVE.com

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenös och Intra-fostervatten In Utero Transplantation i murina modellen

Vi beskriver ett protokoll för att utföra en i livmodern transplantation (IUT) genom intravenös och intra-fostervatten vägar av injektion i murina modellen. Detta protokoll kan användas för att införa celler, virala vektorer och andra ämnen i den unika immun-tolerant fostrets miljön.

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom embryologi, genterapi och stamcellstransplantation. En fördel med denna teknik är att den möjliggör analys av effekterna av olika experimentella terapier på Murine foster. Visar detta förfarande kommer att läkare Nicholas Ahn, och Barbara Coons, läkare och forskare i vårt laboratorium.Innan du börjar förfarandet, släpp fem till 10 mikroliter sterila PBS i och ut ur den kirurgiska nålspetsen, två till tre gånger för att rensa den från eventuella skräp. Nästa fylla nålen med reagens av intresse vid lämplig experimentell volym och koncentration. Och tryck på lägesknappen tre gånger på mikroinjektorn för att gå vidare till injektionskalibreringsskärmen.Lägg till intervaller på 10 eller 100 millisekunder för att justera injektionstiden, och tryck på lägesknappen ytterligare två gånger. Tryck på balansknappen och tryck på fotpedalen en gång. Tryck sedan på pedalen igen och bedöm vilken volym av lösning som töms ut ur nålen per tryck.När mikroinjektorn kalibreras till lämplig experimentell volym fyller du nålen till rätt nivå för injektionen. När alla nålar har rengjorts, bekräfta en brist på svar på tå nypa av den gravida två till sex månader gamla kvinnliga musen. Raka buken, var noga med att inte skada bröstvårtorna, och överför djuret till en värmedyna i ryggläge.Applicera salva på djurets ögon och säkra lemmarna till värmedynan med tejp. Och desinficera den exponerade huden. Injicera sedan lokalbedövningsmedel såsom 100 mikroliter av 0,25%Bupivakain subkutant.Därefter gör en en till två centimeter hud snitt så att den nedre gränsen är inte närmare än en centimeter till introitus, och identifiera mittlinjen av fascia, var noga med att inte skada de omgivande epigastrisk fartyg. Använda Adson-tämpningar, nypa fascian utan att ta tag i någon av de underliggande organen eller foster, och öppna vävnaden med sax. När säkert inom bukhålan, förlänga fascial snitt till längden av huden snitt, och använda bomull spets applikatorer för att flytta tarmarna i den övre delen av buken för att exponera gravid livmodern.Extrahera livmodern genom snittet noggrant identifiera höger och vänster äggstockar för att säkerställa att alla av foster räknas. Placera den vänstra livmodern tillbaka in i buken så att endast den högra livmodern utsätts, för att hålla de icke injicerade foster varm. Och försiktigt greppa vid de mest laterala fosterhinnan säcken mellan tummen och pekfingrarna på den icke dominerande handen.Placera dissekering mikroskop över djuret och justera fokus och belysning för en bättre visualisering av fostret vid behov. För en intravenös injektion rotera livmodern så att vitellin förgäves, som skall injiceras är parallell med nålspetsen. Och lägg nålen på livmodern i fem graders vinkel för att genomborra livmoderväggen.Med spetsen mellan livmoderväggen och fostersäcken, placera spetsen direkt ovanpå vitellin förgäves och i en nästan tangentiell vinkel, glida nålen över fåfänga tills avfasningen förskott i kärlet. Det är absolut nödvändigt att vinkeln förblir låg så att nålen inte tränger in i fartygets bakre vägg. När en fläck av blod observeras vid nålspetsen, för att trycka på fotpedalen för att injicera hela volymen av materialet av intresse i kärlet.För en intra fosterinjektion, rotera fostersäcken tills en plats utan kärl hittas. Peka nålen vinkelrätt mot livmoderväggen och genomborra nålen genom livmoderns gulesäck, och fostersäcken ta hand inte tränga in någon fostervävnad. Injicera sedan lämplig volym av material som önskas.Efter någon av typerna av injektion, dra tillbaka nålen från injektionsstället när den önskade volymen levererats. Och fortsätt till nästa foster tills alla foster i rätt livmoderhorn har injicerats. Sedan tillbaka rätt livmoderhorn i buken.Och ta bort vänster livmoderhorn ur buken. När alla foster i vänster horn har injicerats tillbaka hela livmodern till buken, var noga med att undvika en livmoder eller intestinal volvulus. Använd en engångsöverföringspipett för att fördela cirka två milliliter steril PBS i buken, för att ersätta eventuella okänsliga förluster.Och använd 4-0 polyglactin 910 suturer för att stänga fascia och buken i ett kontinuerligt lager. Överför sedan musen till en ren bur under en värmelampa med övervakning tills full recumbency. I denna utbildning experiment levern av de foster som fått in-utero transplantation av en praktikant visas lägre fluorescerande nivåer 24 timmar efter injektion, på grund av en lägre engraftment av de transplanterade GFP celler, än gjorde lever injiceras av en erfaren instruktör.Flödescytometrisk analys för GFP positiva givarceller korrelerade också med den lägre nivån av fluorescerande observerats under fluorescerande mikroskopi. Förmågan hos viral vektorer levereras via intra-fosterhinnan vägen till transduce celler i kontakt med fosterhinnan vätskan. Är exemplifieras genom transduktion av epitelceller 48 timmar efter in utero injektion av Adeno virus som transporterar GFP transgen i graviditetslängd dag 12,5 foster.När behärskar denna teknik kan avslutas i 15-25 minuter per gravid mus. Efter att ha sett den här videon bör du ha en god förståelse för hur man säkert och effektivt leverera olika terapier till mus foster.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Rumsliga och tidsmässiga analys av aktiva ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; arvslinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Odling av Murina embryonala fotbenen: En fysiologisk modell av endokondral benbildning

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

En ny mammografisk feta padtransplantationsteknik för att visualisera fartygsgenerering av vaskulära endotelceller

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Tillämpningen av RNAi och värme-chock-inducerad transkription faktorn uttryck att omprogrammera könsceller att nervceller i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation analyser att utvärdera bindningen av Drosophila skåran med Trans-ligander och dess hämning av Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-medierad förlust av funktion analys i lillhjärnan Granule celler med hjälp av In Utero elektroporation-baserade genöverföring

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...