Name: single droplet digital polymerase chain reaction for comprehensive and simultaneous detection of mutations in hotspot regions
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها معهد كوري SiRIC (منحة الإنكا-دجوس-4654). الكتاب أيضا أن أشكر حجو كارولين لمساهمتها في الفيديو.

البروتوكول المعروضة هنا يتبع المبادئ التوجيهية الأخلاقية لكوري معهد. وتم الحصول على جميع العينات البشرية من المرضى المسجلين، بعد الموافقة عن علم، في الدراسات التي وافق عليها "مجلس المراجعة المؤسسية" في معهد كوري.
1-جمع وتخزين البلازما واستخراج الحمض النووي خالية من خلايا ال...

<ol>
	<li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Amado, R. G., Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-Type+KRAS+Is+Required+for+Panitumumab+Efficacy+in+Patients+With+Metastatic+Colorectal+Cancer.">Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).</li><li>Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-ras+mutations+and+benefit+from+cetuximab+in+advanced+colorectal+cancer.">K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer.</a> New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).</li><li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA:+a+cancer+diagnostic+perspective.">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li><li>Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+for+triple-negative+breast+cancer+diagnosis+and+treatment+decisions.">Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).</li><li>Decraene, C., Silveira, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Hotspot+Mutations+Scanning+by+Single+Droplet+Digital+PCR.">Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR.</a> Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).</li><li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).</li><li>Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+Comprises+an+In+Vivo+Nucleosome+Footprint+that+Informs+Its+Tissues-Of-Origin.">Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.</a> Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).</li><li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay.">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li><li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddpcr:+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data.">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COSMIC:+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution.">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li></ol>

تصميم مقايسة دبكر الإنزال كفاءة والأمثل الحاسم، والبروتوكول يجب أن تتبع بدقة. وقد كل تركيبة الإشعال والمسابير من كفاءة تفاعل PCR فريدة من نوعها. وهكذا، قد مقايسة فردية سيتم التحقق من عينات مراقبة بعناية قبل استخدامها في عينات اختبار قيمة. الأمثل والتحقق من الصحة مهمة التصديق على الكشف عن إ?...

آلاف طفرات الجسدية المتصلة بالتنمية سرطان قد أبلغ عنها1. بين هؤلاء، هناك عدد قليل من علامات تنبؤية لفعالية العلاج المستهدفة 2،3 وفحص هذه الطفرات الوراثية الممارسة السريرية الروتينية الآن. الحبرية، التكنولوجيا الرقمية على بكر (دبكر) يمكن استخدامها لرصد للوجود أو عدم وجود الطفرات مع كشف عالية الدقة، وهو متوافق بشكل كبير مع خزعات السائلة غير الغازية4،5. ومع ذلك، تشنيع الحالية دبكر فحوصات للكشف عن الطفرات معروفة مسبقاً. وهذا يحد بشدة استخدام دبكر كأداة لاكتشاف عند الطفرة غير معروف. في الواقع، في تصميم دبكر التقليدية، مجس التحلل إذ تسلم اليل البرية من نوع (WT مسبار) تتنافس مع تحقيق محددة إذ تسلم اليل المسخ (موت مسبار) (الشكل 1A). التحقيق مع تقارب أعلى هيبريديزيس إلى القالب، والنشرات في فلوروفوري، مما يشير إلى طبيعة اليل المقابلة. يمكن تصور الأسفار البيانات التي تم الحصول عليها لكل قطره في مؤامرة مبعثر يمثلون الأسفار المنبعثة من المسابر WT وموت في أبعاد مختلفة. تمثيل تخطيطي لنتيجة نموذجية مقايسة دبكر تقليدية ترد في الشكل 1A. في هذا المثال، يناظر سحابة زرقاء قطرات تحتوي على الآليلات WT حددها التحقيق WT، بينما سحابة حمراء يطابق قطرات الذي تم تضخيمه اليل موت وحددها التحقيق موت. اعتماداً على كمية الحمض النووي محملة في رد الفعل، يمكن أن تظهر قطرات إيجابية مزدوجة تحتوي على أمبليكونس WT وموت (سحابة الخضراء). سحابة رمادية خفيفة يطابق قطرات فارغة.
حيث تسمح معظم المنصات للكشف عن عدد محدود من فلوروفوريس (عادة ما تكون 2، بل تصل إلى 5)، يقتصر إنتاجية دبكر التقليدية. ولذلك، استهداف المناطق مع الطفرات المتاخمة متعددة يتطلب تصميم تحديا تقنيا فحوصات دبكر متعدد أو استخدام ردود فعل متعددة تستهدف كل طفرة في نفس الوقت. الاستراتيجية دبكر الإنزال، ويتغلب على هذا القيد كما يحتمل أن يمكن الكشف عن أي تغيير الوراثية داخل منطقة مستهدفة استخدام زوج فريدة من المسابر التحلل WT. ومن المتوقع أول مجس (مسبار 1) يغطي تسلسل غير متغيرة، المتاخمة للمنطقة المستهدفة والتحقيق الثاني (المسبار 2) مكمل لتسلسل المنطقة المستهدفة حيث الطفرات WT (الشكل 1B). في حين أن التحقيق الأولى يقد المبلغ الإجمالي لجزيئات أمبليفيابل في رد الفعل، يميز التحقيق الثاني الآليلات WT وموت بالتهجين دون المستوى الأمثل لتسلسل متحولة. المسبار 2 يمكن تحديد أنواع متعددة من الطفرات في المنطقة (نوكليوتيد واحد أو عدة بدائل، الحذف، إلخ) الهدف6. كما هو الحال في دبكر التقليدية، سحابة رمادية خفيفة يطابق قطرات تحتوي على لا جزيئات الحمض النووي. من المهم أن نذكر أن الفصل الأمثل الغيوم WT وموت في هذا النوع من التحليل، تعتمد على الكمية من الحمض النووي محملة في رد الفعل، حيث لا يمكن تمييزها قطرات تحتوي على وزن وموت الآليلات الهدف من قطرات تحتوي على فقط وزن النموذج. ولذلك، يتطلب هذا التحليل أن معظم قطرات تحتوي على لا أكثر من نسخة واحدة من الجينات المستهدفة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K2EDTA tube (color code : lavender)</td>
			<td>BD</td>
			<td>367863</td>
			<td>EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>For isolation of free-circulating DNA from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>937556</td>
			<td>For isolation of free-circulating DNA from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAsymphony SP system</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001297</td>
			<td>fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td>For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX100 or QX200 reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3003 or186-4003, respectively</td>
			<td>The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX100 or QX200 droplet generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3002 or 186-4002, respectively</td>
			<td>Instrument used for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td>Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>181-4000</td>
			<td>PX1&#8482; PCR plate sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge holder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3051</td>
			<td>Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartridges and gaskets</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-4007</td>
			<td>Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3010</td>
			<td>ddPCR supermix for probes (no dUTP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020362</td>
			<td>96-well semi-skirted plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>181-4040</td>
			<td>Pierceable foil heat seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3004</td>
			<td>oil used in the read</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3005</td>
			<td>oil for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.051</td>
			<td>Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex I cfDNA Reference Standard Set</td>
			<td>HORIZON</td>
			<td>HD780</td>
			<td>The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&#181;L to 100 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Qubit assay tubes are 500 &#181;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single droplet digital polymerase chain reaction for comprehensive and simultaneous detection of mutations in hotspot regions

التجميعية الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (دبكر) أسلوب تفاعل المتسلسل (PCR) بوليميريز كمية حساسة للغاية تستند إلى وجود عينة إلى الآلاف من ردود الفعل الفردية الماء في النفط التي نانو الحجم. في الآونة الأخيرة، أصبح دبكر واحدة من الأدوات الأكثر دقة وحساسية لتعميم الورم كشف الحمض النووي (كتدنا). أحد القيود الرئيسية التي تقنية دبكر القياسي هو تقييد عدد الطفرات التي يمكن أن يكون فحص كل رد فعل، التي تلزم بتحقيقات محددة التحلل الاعتراف بكل إصدار الاليلي ممكن. منهجية بديلة، دبكر الإنزال، يزيد الإنتاجية، نظراً لأنها تتطلب فقط زوج واحد من تحقيقات لكشف وتحديد يحتمل أن تكون كافة التعديلات الوراثية في المنطقة المستهدفة. يعرض دبكر الإنزال حساسية قابلة للمقارنة لفحوصات دبكر التقليدية مع ميزة الكشف عن عدد أكبر من الطفرات في رد فعل واحد. فعالة من حيث التكلفة، ويحافظ على المواد الثمينة عينة، ويمكن أيضا استخدامها كأداة لاكتشاف عند حدوث طفرات غير معروفة مسبقاً.

في دراسة لمفهوم الإثبات، تم التحقيق في كراس إكسون 2 الطفرات (codons 12 و 13) والحذف 19 إكسون EGFR في عينات البلازما من مرضى السرطان باستخدام استراتيجية دبكر الإنزال6والأنسجة FFPE.
التحقيق الإنزال كراس استجواب 16 منطقة bp يش?...

Watch this Scientific Journal Video about Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions at JoVE.com

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

نقدم هنا، بروتوكولا لدقة تحديد مقدار التعديلات الوراثية متعددة من المنطقة المستهدفة في رد فعل واحد استخدام دبكر الإنزال وزوج فريدة من المسابر التحلل المائي.

قطره واحدة رقمي البلمرة المتسلسل لكشف شامل ومتزامن من الطفرات في المناطق الساخنة

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

يمكن استخدام هذه الطريقة كأداة تشخيصية للسرطان لتحليل الحمض النووي للورم المتداول. هذه التقنية تستجوب التغيير الجيني المتعدد في مناطق الطفرات العنقودية في رد فعل واحد. وهذا يساعد على حفظ عينات المريض الثمينة.يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لعبء الورم على ملفه الطفرة. ويمكن الآن أيضا أن تطبق على التحليل الجزيئي كبديل لـ QPCR للحصول على تحديد كمي مطلق لتسلسلات هدف الحمض النووي. جمع عينات الدم في أنابيب EDTA سبعة ملليلتر.يوصى بأنبوبين لجمع حوالي أربعة ملليلترات من البلازما. أجهزة الطرد المركزي عينات الدم لمدة 10 دقائق في 820 مرة الجاذبية في غضون ثلاث ساعات من سحب الدم لفصل خلايا الدم الحمراء، وخلايا الدم البيضاء، والبلازما. الوقت بين أخذ العينات والطرد المركزي أمر بالغ الأهمية للحصول على عالية الجودة، والخلايا T خالية من الحمض النووي غير ملوثة بالحمض النووي الصادر من خلايا الدم البيضاء.بعد الطرد المركزي، استخدم ماصة مصلية لجمع المابسة دون لمس طبقة خلايا الدم البيضاء. عادة ما يتم استرداد حوالي مليلتر من البلازما في أنبوب EDTA. بعد نقل البلازم إلى أنبوبين ملليلتر، الطرد المركزي aliquots في 16، 000 مرة الجاذبية لمدة 10 دقائق في 15 درجة مئوية لإزالة حطام الخلية.جمع البلازما بعناية دون إزعاج بيليه ونقلها إلى اثنين من أنابيب المبردة ملليلتر. تخزين في درجة مئوية سلبية 80 حتى الحاجة. تبدأ بإضافة 400 ميكرولترات من البروتينات K إلى أنبوب 50 ملليلتر.ثم، إضافة أربعة ملليلتر من البلازما و 3.2 ملليلتر من ACL تحلل العازلة التي تحتوي على ميكروغرام واحد من الحمض النووي الريبي الناقل من عدة الاستخراج. أغلق الأنبوب واخلطه عن طريق الدوامة لمدة 30 ثانية للحصول على حل متجانس. ثم، احتضان في 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.بعد الحضانة، إضافة 7.2 ملليلتر من ACB العازلة إلى lysate لتحسين الربط من الأحماض النووية المتداولة إلى غشاء السيليكا. مزيج من خلال دوامة لمدة 15 إلى 30 ثانية. ثم، احتضان الأنبوب على الجليد لمدة خمس دقائق.إرفاق العمود وموسع 20 ملليلتر على مضخة فراغ. إغلاق الأجزاء غير المستخدمة للسماح للفراغ الطموح. بعد الطرد المركزي لفترة وجيزة الأنبوب، أدخل بعناية الخليط في موسع الأنبوب.ثم التبديل على مضخة فراغ والسماح لlysate أن يوجه من خلال الأعمدة تماما. إزالة وإزاحة موسع الأنبوب. بعد ذلك، تطبيق 600 ميكرولترات من ACW1 العازلة إلى العمود.عندما تم رسمها ACW1 المخزن المؤقت من خلال العمود، إضافة 750 ميكرولترات من ACW2 العازلة، وأخيرا، 750 ميكرولترات من 96 إلى 100٪ الإيثانول. ثم، ضع العمود في أنبوب جمع 2 ملليلتر نظيفة وطاردة مركزية بأقصى سرعة لمدة ثلاث دقائق للقضاء على الإيثانول. بعد وضع العمود في أنبوب جمع مليلتر جديد ، افتح الغطاء ثم احتضنه عند درجة 56 مئوية لمدة 10 دقائق لتجفيف الغشاء تمامًا.بعد الحضانة، ضع العمود في أنبوب 1.5 ملليلتر منخفض الربط. تطبيق بعناية 36 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase مع 0.04٪ أزيد الصوديوم. ثم أغلق الغطاء واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق.جهاز طرد مركزي في سرعة كاملة مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة ل elute الأحماض النووية. ثم، وتخزين في درجة مئوية سلبية 20 حتى الحاجة. تبدأ عن طريق ذوبان وتكذيب مكونات التفاعل إلى درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك السيارة PCR نظيفة.ثم إعداد مزيج 20 مرة من التمهيدية والتحقيقات في RNase والمياه المقطرة خالية من Dnase مع كل التمهيدي في 18 تركيز micromolar وكل مسبار في خمسة تركيزات ميكرومولار. لجميع ردود الفعل PCR الفردية، وإعداد مزيج عينة من خلال الجمع بين 10 ميكرولترات من مرتين ddPCR Supermix، وميكر واحد من 20 مرة التمهيدية ومزيج تحقيقات، وما يصل إلى 10 نانوغرام من عينة الحمض النووي في 20 ميكرولترات من الماء المقطر. دوامة تفاعل خليط بدقة لضمان التجانس.وباختصار من الطرد المركزي لجمع محتويات في الجزء السفلي من الأنبوب قبل الاستغناء. أدخل خرطوشة ddPCR في الحامل وحمّل 20 ميكرولترات من مزيج تفاعل العينة في الآبار الوسطى للخراطيش لتوليد القطيرات. إضافة 70 ميكرولترات من زيت المولدات القطيرة في الآبار السفلية.أدخل الكارتريدج مع طوقا في مولد القطرات. سيتم إنتاج قطرات في الآبار العليا من الخراطيش. ببطء وبلطف 40 ميكرولترات من قطرات من الخراطيش والاستغناء في لوحة PCR 96-well.ختم لوحة PCR النهائي مع رقائق الألومنيوم باستخدام ختم لوحة مباشرة بعد نقل قطرات لتجنب التبخر. طرد مركزي لفترة وجيزة لوحة لجمع محتويات في الجزء السفلي من الآبار. تشغيل تضخيم PCR التقليدية على دورة حرارية.عندما يتم الانتهاء من تشغيل، وطاردة مركزية لفترة وجيزة لوحة لجمع محتويات في الجزء السفلي من الآبار. بعد تضخيم PCR، استخدم قارئ القطرات لحساب PCR إيجابية وPCR قطرات سلبية بعد تعليمات الشركة المصنعة. فيما يلي نتائج تمثيلية تم الحصول عليها أثناء خطوات التحسين من المقايسة ddPCR الإنزال.تُظهر هذه الصورة الكشف عن الحمض النووي المتحول والحمض النووي من النوع البري في تفاعل يحتوي على حمض نووي متحول بنسبة 100٪، و5٪ حمض نووي متحول، و100٪ حمض نووي من النوع البري. هذه الصورة تظهر أمثلة من عينات البلازما تحليلها مع KRAS وEGFR إسقاط المقايسة DdPCR تبين الكشف عن النيوكليوتيدات واحدة وبدائل متعددة في إكسون اثنين من KRAS وحذف في EGFR exon 19. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم المضي بعناية في كل خطوة مع اهتمام خاص في جيل القطرات ، وهي خطوة حاسمة في هذا الأسلوب.بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحث والعيادة في مجال أبحاث السرطان لتحسين تحليل طفرة الورم باستخدام خزعة سائلة.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

DNA, Cells, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

تحسين تفاعل البلمرة المتسلسل-تقييد جزء طول تعدد الأشكال الجيني من ينفوخية السامة من قبل اللوني السائل / قياس الطيف الكتلي

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

كشف اللونية البصرية من متعدد النوكليوتيدات تعدد الأشكال على منصة التلاعب هوائي القطرة

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

من النوع البري منع PCR جنبا إلى جنب مع التسلسل المباشر كوسيلة الحساسة بشدة للكشف عن التردد المنخفض الجسدية الطفرات

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

ريتروفيرال المسح الضوئي: تعيين مواقع تكامل ملف لتحديد المناطق التنظيمية الخاصة بالخلية

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

كريسبر بوساطة إعادة تنظيم هيكل حلقة الكروماتين

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

التمايز، والصيانة، وتحليل خلايا ظهارة صباغ الشبكية البشرية: نموذج المرض في طبق للطفرات BEST1

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

تقييم تفاعل البلمره المتسلسل المتداخل العالمي للكشف عن فيروسات الليسايسيس

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...