Name: single droplet digital polymerase chain reaction for comprehensive and simultaneous detection of mutations in hotspot regions
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). De auteurs bedank ook Caroline Hego voor haar bijdrage aan de video.

Het hier gepresenteerde protocol volgt de richtlijnen van de ethiek van het Institut Curie. Alle menselijke specimens zijn verkregen van patiënten ingeschreven, na de geïnformeerde toestemming, in studies die zijn goedgekeurd door de institutionele Review Board op Institut Curie.
1. het bloed van verzameling, Plasma opslag en cel-gratis DNA-extractie
Opmerking: DNA geëxtraheerd uit elk type "weefsel" kan worden gebruikt (bijvoorbeeld vers of formaldehyde-v...

<ol>
	<li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Amado, R. G., Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-Type+KRAS+Is+Required+for+Panitumumab+Efficacy+in+Patients+With+Metastatic+Colorectal+Cancer.">Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).</li><li>Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-ras+mutations+and+benefit+from+cetuximab+in+advanced+colorectal+cancer.">K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer.</a> New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).</li><li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA:+a+cancer+diagnostic+perspective.">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li><li>Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+for+triple-negative+breast+cancer+diagnosis+and+treatment+decisions.">Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).</li><li>Decraene, C., Silveira, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Hotspot+Mutations+Scanning+by+Single+Droplet+Digital+PCR.">Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR.</a> Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).</li><li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).</li><li>Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+Comprises+an+In+Vivo+Nucleosome+Footprint+that+Informs+Its+Tissues-Of-Origin.">Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.</a> Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).</li><li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay.">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li><li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddpcr:+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data.">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COSMIC:+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution.">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li></ol>

Voor het ontwerpen van een efficiënte drop-off ddPCR assay, optimalisatie is cruciaal, en het protocol moet zorgvuldig worden gevolgd. Elke combinatie van primers en sondes heeft een unieke PCR reactie efficiëntie. Een afzonderlijke bepaling moet dus zorgvuldig worden gevalideerd op controlemonsters alvorens te worden gebruikt op waardevolle proefmonsters. Optimalisatie en validatie zijn belangrijk voor het certificeren van piek signaal detectie en beoordelen van de gevoeligheid en specificiteit. Zoals beschreven in he...

Duizenden van somatische mutaties die betrekking hebben op kankerontwikkeling zijn gerapporteerde1. Daaronder een paar zijn voorspellende markers van de werkzaamheid van gerichte therapie 2,3 en genetische screening van deze mutaties is nu gangbare klinische praktijk. Droplet-technologie voor digitale PCR (ddPCR) kan worden gebruikt om te controleren op de aanwezigheid of de afwezigheid van mutaties met weetje speurder nauwkeurigheid en is zeer compatibel met niet-invasieve vloeibare biopsieën4,5. Huidige ddPCR testen zijn echter voornamelijk ontworpen om mutaties bekend een prioridetecteren. Dit beperkt ernstig het gebruik van ddPCR als een ontdekkingshulpmiddel wanneer de mutatie onbekend is. Inderdaad, in het ontwerp van de conventionele ddPCR, een sonde van de hydrolyse herkennen van het wild-type allel (WT sonde) concurreert met een specifieke sonde herkennen de mutant allel (MUT sonde) (figuur 1A). De sonde met hogere affiniteit aan de sjabloon hybridizes en haar fluorophore, met vermelding van de aard van de overeenkomstige allel releases. De gegevens van de fluorescentie verkregen voor elke druppel kunnen worden gevisualiseerd in een scatterplot vertegenwoordigen de fluorescentie die wordt uitgestoten door de WT en MUT sondes in verschillende dimensies. In figuur 1Ais een schematische weergave van een typisch resultaat voor een conventionele ddPCR assay gepresenteerd. In dit voorbeeld, de blauwe wolk komt overeen met de druppels met WT allelen geïdentificeerd door de WT sonde, overwegende dat de rode wolk correspondeert met druppels waarin de MUT-allel is versterkt en geïdentificeerd door de MUT-sonde. Afhankelijk van de hoeveelheid DNA geladen in de reactie, dubbele positieve druppels met zowel WT en MUT waarbij kunnen worden weergegeven (groene wolk). De licht grijze wolk komt overeen met lege druppels.
Aangezien de meeste platformen toestaan voor de detectie van een beperkt aantal fluorophores (meestal 2, maar maximaal 5), is doorvoer van conventionele ddPCR beperkt. Targeting van regio's met meerdere aangrenzende mutaties vereist daarom ontwerp van technisch uitdagende multiplex ddPCR testen of het gebruik van meerdere reacties gericht op elke mutatie in parallel. De drop-off ddPCR strategie, overwint deze beperking zoals het potentieel kan detecteren elke genetische wijziging binnen de regio van een doel met behulp van een uniek paar WT hydrolyse sondes. De eerste sonde (sonde 1) omvat die een reeks van de niet-variabele, grenzend aan de target-regio en de tweede sonde (sonde 2) is een aanvulling op de WT-volgorde van de doel-regio waar de mutaties zijn verwacht (figuur 1B). Terwijl de eerste sonde de totale hoeveelheid amplifiable moleculen in de reactie kwantificeert, discrimineert de tweede sonde WT en MUT allelen door suboptimale hybridisatie aan mutant sequenties. Sonde 2 herkent meerdere soorten mutaties in de regio (enkelvoudige of meervoudige nucleotide vervangingen, verwijdering, enz.) van doelstelling6. Zoals in conventionele ddPCR correspondeert de licht grijze wolk druppels met geen DNA-moleculen. Het is belangrijk eraan te herinneren dat in dit type van test, optimale scheiding van WT en MUT wolken afhankelijk van de hoeveelheid DNA geladen in de reactie is, omdat druppels met zowel WT en MUT doel allelen niet kunnen worden onderscheiden van druppels met alleen de WT formulier. Deze test vereist daarom bevatten de meeste druppels niet meer dan één exemplaar van de gerichte gen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K2EDTA tube (color code : lavender)</td>
			<td>BD</td>
			<td>367863</td>
			<td>EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>For isolation of free-circulating DNA from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>937556</td>
			<td>For isolation of free-circulating DNA from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAsymphony SP system</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001297</td>
			<td>fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td>For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX100 or QX200 reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3003 or186-4003, respectively</td>
			<td>The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX100 or QX200 droplet generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3002 or 186-4002, respectively</td>
			<td>Instrument used for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td>Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>181-4000</td>
			<td>PX1&#8482; PCR plate sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge holder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3051</td>
			<td>Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartridges and gaskets</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-4007</td>
			<td>Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3010</td>
			<td>ddPCR supermix for probes (no dUTP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020362</td>
			<td>96-well semi-skirted plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>181-4040</td>
			<td>Pierceable foil heat seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3004</td>
			<td>oil used in the read</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3005</td>
			<td>oil for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.051</td>
			<td>Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex I cfDNA Reference Standard Set</td>
			<td>HORIZON</td>
			<td>HD780</td>
			<td>The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&#181;L to 100 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Qubit assay tubes are 500 &#181;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single droplet digital polymerase chain reaction for comprehensive and simultaneous detection of mutations in hotspot regions

Druppel digitale polymerase-kettingreactie (ddPCR) is een zeer gevoelige kwantitatieve polymerase kettingreactie (PCR) methode gebaseerd op monster fractionering in duizenden nano-sized water-in-olie individuele reacties. Onlangs, ddPCR is uitgegroeid tot een van de meest nauwkeurige en gevoelige instrumenten voor circulerende tumor (ctDNA) DNA detectie. Een van de belangrijkste beperkingen van de standaard ddPCR-techniek is het beperkte aantal mutaties die kan worden gescreend per reactie, zoals specifieke hydrolyse sondes herkennen van elke mogelijke allèlique versie nodig zijn. Een alternatieve methode, de drop-off ddPCR, verhoogt de doorvoer, omdat het vereist slechts een paar van sondes voor het detecteren en kwantificeren van potentieel alle genetische veranderingen in het gerichte gebied. Drop-off ddPCR toont vergelijkbare gevoeligheid aan conventionele ddPCR testen met het voordeel van het opsporen van een groter aantal mutaties in een enkele reactie. Het is rendabel, conserveert kostbare monstermateriaal, en kan ook worden gebruikt als een ontdekkingshulpmiddel mutaties zijn niet bekend een priori.

KRAS exon 2 mutaties (codonen 12 en 13) en EGFR exon 19 verwijderingen in een bewijs-van-concept studie, werden in FFPE weefsels en plasma monsters van kankerpatiënten met behulp van de drop-off ddPCR strategie6onderzocht.
De KRAS drop-off sonde ondervraagd een 16 bp regio omvat meerdere mutaties in exon 2 van de KRAS -gen, die meer dan 95% van de bekende KRAS </em...

Watch this Scientific Journal Video about Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions at JoVE.com

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Hier presenteren we een protocol om meerdere genetische wijzigingen van een target gebied in een enkele reactie drop-off ddPCR met een unieke combinatie van hydrolyse sondes nauwkeurig te kwantificeren.

Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Deze methode kan worden gebruikt als een diagnostisch instrument voor kanker om de circulerende tumor DNA te analyseren. Deze techniek ondervraagt meerdere genetische veranderingen in gebieden van clustermutaties in een enkele reactie. Dit helpt om kostbare patiëntmonsters te besparen.Deze methode kan inzicht geven in de tumorbelasting op het mutatieprofiel. Het kan nu ook worden toegepast op een moleculaire analyse als alternatief voor qPCR om een absolute kwantificering van nucleïnezuur doelsequenties te verkrijgen. Verzamel bloedmonsters in zeven-milliliter EDTA buizen.Twee buizen worden aanbevolen om ongeveer vier milliliter plasma te verzamelen. Centrifuge de bloedmonsters gedurende 10 minuten bij 820 keer zwaartekracht binnen drie uur na de bloedafname om rode bloedcellen, witte bloedcellen en plasma te scheiden. De tijd tussen de bemonstering en de centrifugatie is van cruciaal belang om hoogwaardig, T-celvrij DNA te verkrijgen dat niet besmet is met DNA dat vrijkomt uit witte bloedcellen.Gebruik na centrifugatie een serologische pipet om de supernatant te verzamelen zonder de witte bloedcellaag aan te raken. Ongeveer twee milliliter plasma worden meestal teruggewonnen per EDTA buis. Na het overbrengen van de plasmen naar twee milliliter buizen, centrifugeren de aliquots op 16.000 keer de zwaartekracht gedurende 10 minuten op 15 graden Celsius om celpuin te verwijderen.Verzamel het plasma zorgvuldig zonder de pellet te verstoren en breng over op twee milliliter cryogene buizen. Bewaar op negatieve 80 graden Celsius tot dat nodig is. Begin met het toevoegen van 400 microliter proteinase K aan een buis van 50 milliliter.Voeg vervolgens vier milliliter plasma en 3,2 milliliter ACL lyse buffer met een microgram drager RNA uit de extractiekit. Sluit de buis en meng door vortexing voor 30 seconden om een homogene oplossing te verkrijgen. Dan, incubeer op 60 graden Celsius gedurende 30 minuten.Voeg na de incubatie 7,2 milliliter buffer ACB toe aan het lysaat om de binding van de circulerende nucleïnezuren aan het silicamembraan te optimaliseren. Meng door vortexing voor 15 tot 30 seconden. Dan, incubeer de buis op ijs gedurende vijf minuten.Bevestig de kolom en de 20 milliliter extender op de vacuümpomp. Sluit de ongebruikte porties om vacuüm aspiratie mogelijk te maken. Na het kort centrifugeren van de buis, voorzichtig het mengsel in de buis extender.Schakel vervolgens de vacuümpomp in en laat het lysaat volledig door de kolommen worden getrokken. Verwijder en gooi de buis extender. Breng vervolgens 600 microliter buffer ACW1 aan op de kolom.Wanneer buffer ACW1 door de kolom heeft getrokken, voeg 750 microliter acw2-buffer toe en ten slotte 750 microliter van 96 tot 100% ethanol. Plaats de kolom vervolgens in een schone opvangbuis van twee milliliter en vercentrifuge drie minuten op volle snelheid om ethanol te elimineren. Na het plaatsen van de kolom in een nieuwe twee milliliter opvangbuis, open het deksel en vervolgens incubeer op 56 graden Celsius gedurende 10 minuten om het membraan volledig te drogen.Plaats de kolom na de incubatie in een schone 1,5 milliliter laagbindende buis. Breng voorzichtig 36 microliter RNase-vrij water aan met 0,04% natriumajaide. Sluit vervolgens het deksel en broed drie minuten op kamertemperatuur.Centrifuge weer op volle snelheid voor een minuut om de nucleïnezuren te ontwijken. Dan, op te slaan op negatieve 20 graden Celsius tot dat nodig is. Begin met het ontdooien en equilibreren van de reactiecomponenten op kamertemperatuur in een schone PCR-kap.Bereid vervolgens een 20 keer mix van primers en sondes in RNase en Dnase-vrij gedestilleerd water met elke primer op 18 micromolar concentratie en elke sonde op vijf micromolar concentratie. Voor alle individuele PCR reacties, bereid een monster mix door het combineren van 10 microliter van twee keer ddPCR Supermix, een microliter van 20 keer primers en sondes mix, en tot 10 nanogram van het DNA-monster in 20 microliter van gedestilleerd water. Vortex het reactiemengsel grondig om homogeniteit te garanderen.En even centrifugeren om inhoud te verzamelen aan de onderkant van de buis voor het verstrekken. Steek de ddPCR-cartridge in de houder en laad 20 microliter monsterreactiemix in de middelste putten van de cartridge voor druppelgeneratie. Voeg 70 microliter druppelgeneratorolie toe aan de onderste putten.Steek de cartridge met een pakking in de druppelgenerator. Druppels worden geproduceerd in de bovenste putten van de cartridge. Langzaam en voorzichtig 40 microliter van de druppels uit de cartridges aanzuigen en in een PCR-plaat met 96 putten af te geven.Verzegel de uiteindelijke PCR-plaat met aluminiumfolie met behulp van een plaatafdichter onmiddellijk na het overbrengen van druppels om verdamping te voorkomen. Vercentrifugeert de plaat kort om de inhoud aan de onderkant van de putten te verzamelen. Voer een conventionele PCR-versterking uit op een thermische cycler.Wanneer de run is voltooid, kort centrifugeren de plaat om inhoud te verzamelen aan de onderkant van de putten. Gebruik na PCR-versterking de druppellezer om pcr-positieve en PCR-negatieve druppels te tellen volgens de instructies van de fabrikant. De volgende zijn representatieve resultaten verkregen tijdens optimalisatiestappen van de drop-off ddPCR test.Deze afbeelding toont detectie van mutant DNA en wild-type DNA in een reactie die 100% mutant DNA, 5% mutant DNA, en 100% wild-type DNA. Deze afbeelding toont voorbeelden van plasmamonsters geanalyseerd met de KRAS en EGFR drop-off ddPCR testen waaruit blijkt dat de detectie van enkele nucleotide en meerdere substituties in exon twee van KRAS en een schrapping in EGFR exon 19. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om zorgvuldig te werk te gaan bij elke stap met een speciale aandacht op de druppelgeneratie, dat is een kritieke stap van deze methode.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoeker en clinicus op het gebied van kankeronderzoek om de tumormutatieanalyse te optimaliseren met behulp van vloeibare biopsie.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

DNA, Cells, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Verbeterde Polymerase Chain Reaction-restrictiefragmentlengtepolymorfisme Genotypering van Toxic Pufferfish door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

De Visual Colorimetrische Detectie van Multi-nucleotide polymorphisms op een pneumatische Droplet Manipulation Platform

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Wild-blokkering van PCR In combinatie met Direct Sequencing als een zeer gevoelige detectiemethode voor Low-Frequency somatische mutaties

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regio&#39;s te definiëren

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-gemedieerde reorganisatie van chromatine lusstructuur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiatie, onderhoud en analyse van menselijke retinale Pigment epitheel cellen: een ziekte-in-a-schotel-Model voor BEST1 mutaties

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificatie van homologe recombinatie gebeurtenissen in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern Blotting en de Kettingreactie van de Polymerase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluatie van een universele geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie voor de opsporing van Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...