Name: single droplet digital polymerase chain reaction for comprehensive and simultaneous detection of mutations in hotspot regions
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Institut Curie SiRIC (Grant Inka-DGOS-4654) unterstützt. Die Autoren möchte auch Caroline Hego für ihre Verdienste um das Video zu danken.

Die hier vorgestellten Protokoll folgt den Ethikrichtlinien des Institut Curie. Alle menschlichen Proben stammen von Patienten, nach Einwilligung in Studien von Institutional Review Board am Institut Curie genehmigt.
(1) Blut Sammlung, Plasma Speicherung und zellfreie DNA-Extraktion
Hinweis: Bei jeder Art von "Gewebe" extrahierte DNA verwendet werden (z. B. frisch oder Formaldehyd-feste Paraffin eingebettet (FFPE) Gewebe, Zellen in Kultur oder Blutproben). Hi...

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	<li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Amado, R. G., Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-Type+KRAS+Is+Required+for+Panitumumab+Efficacy+in+Patients+With+Metastatic+Colorectal+Cancer.">Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).</li><li>Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-ras+mutations+and+benefit+from+cetuximab+in+advanced+colorectal+cancer.">K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer.</a> New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).</li><li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA:+a+cancer+diagnostic+perspective.">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li><li>Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+for+triple-negative+breast+cancer+diagnosis+and+treatment+decisions.">Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).</li><li>Decraene, C., Silveira, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Hotspot+Mutations+Scanning+by+Single+Droplet+Digital+PCR.">Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR.</a> Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).</li><li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).</li><li>Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+Comprises+an+In+Vivo+Nucleosome+Footprint+that+Informs+Its+Tissues-Of-Origin.">Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.</a> Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).</li><li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay.">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li><li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddpcr:+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data.">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COSMIC:+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution.">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li></ol>

Um eine effiziente Drop-off-DdPCR-Assay zu entwerfen, Optimierung ist entscheidend, und das Protokoll muss sorgfältig beachtet werden. Jede Kombination von Primer und Sonden hat eine einzigartige Effizienz der PCR-Reaktion. So hat eine einzelne Probe sorgfältig auf Kontrollproben überprüft werden, bevor Sie auf wertvolle Proben verwendet wird. Optimierung und Validierung sind wichtig zur Zertifizierung Peak Signalerkennung und Spezifität und Sensitivität zu beurteilen. Wie im Protokoll beschrieben, können potenzie...

Tausende von somatischen Mutationen, die im Zusammenhang mit Krebsentstehung wurden berichtet1. Unter diesen sind einige prädiktive Marker für die Wirksamkeit der gezielten Therapie 2,3 und genetisches screening dieser Mutationen ist jetzt klinischen Routine. Tröpfchen-Digitaltechnik-PCR (DdPCR) verwendet werden, um das Vorhandensein oder das Fehlen von Mutationen mit hoher Erkennungsgenauigkeit zu überwachen und ist sehr kompatibel mit nicht-invasiven flüssigen Biopsien4,5. Aktuelle DdPCR Assays sind jedoch in erster Linie Mutationen bekannt a-priorizu erkennen. Dies schränkt die Verwendung von DdPCR als ein Discovery-Tool die Mutation ist nicht bekannt. In der Tat konkurriert in der konventionellen DdPCR Design, eine Hydrolyse-Sonde erkennt das Wildtyp Allel (WT-Sonde) mit einer speziellen Sonde erkennen die mutierten Allels (MUT-Sonde) (Abbildung 1A). Sonde mit höherer Affinität zur Vorlage hybridisiert und veröffentlicht seine Fluorophor, unter Angabe der Art des entsprechenden Allels. Die Fluoreszenz Daten für jedes Tröpfchen können in einem Streudiagramm repräsentieren die Fluoreszenz emittiert durch den WT und MUT Sonden in verschiedenen Dimensionen visualisiert werden. Eine schematische Darstellung der ein typisches Ergebnis für einen herkömmlichen DdPCR-Assay ist in Figur 1Apräsentiert. In diesem Beispiel entspricht die Blaue Wolke Tröpfchen mit WT Allele identifiziert durch die WT-Sonde, während die rote Wolke Tröpfchen entspricht in der MUT-Allel verstärkt und durch die MUT-Sonde identifiziert. Abhängig von der Menge der DNA in der Reaktion geladen können doppelte positive Tröpfchen mit WT und MUT Amplifikate (grüne Wolke) angezeigt werden. Die helle graue Wolke entspricht leer Tröpfchen.
Da die meisten Plattformen für den Nachweis von einer begrenzten Anzahl von Fluorophore (in der Regel 2, aber bis zu 5) ermöglichen, ist Durchsatz von konventionellen DdPCR begrenzt. Daher erfordert die Ausrichtung auf Regionen mit mehreren angrenzenden Mutationen Design von technisch anspruchsvollen multiplex DdPCR Assays oder die Verwendung von mehreren Reaktionen auf jede Mutation parallel. Die Drop-off-DdPCR-Strategie, überwindet diese Einschränkung, da es möglicherweise genetische Veränderung innerhalb einer Zielregion mit einer einzigartigen WT Hydrolyse Sonden erkennen kann. Die erste Sonde (Sonde 1) Abdeckungen ist eine nicht-Variablen Sequenz, angrenzend an die Zielregion und die zweite Sonde (Sonde 2) Ergänzend zu der WT-Sequenz der Zielregion wo Mutationen sind zu erwarten (Abbildung 1 b). Während die erste Sonde den Gesamtbetrag der amplifiable Moleküle in der Reaktion quantifiziert, diskriminiert die zweite Sonde WT und MUT Allele durch suboptimale Hybridisierung auf mutierte Sequenzen. Fühler 2 kann mehrere Arten von Mutationen in der Ziel-Region (einzelne oder mehrere Nukleotid Substitutionen, löschen, etc.)-6identifizieren. Wie bei konventionellen DdPCR entspricht die helle graue Wolke Tröpfchen enthalten keine DNA-Moleküle. Es ist wichtig, daran zu erinnern, dass bei dieser Art des Tests, optimale Trennung von WT und MUT Wolken abhängig von der Menge der DNA geladen in der Reaktion ist, da Tröpfchen mit WT und MUT Ziel Allele von Tröpfchen enthalten nur das WT nicht zu unterscheiden Form. Dieser Test erfordert daher, dass die meisten Tropfen nicht mehr als eine Kopie des Gens gezielte enthalten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K2EDTA tube (color code : lavender)</td>
			<td>BD</td>
			<td>367863</td>
			<td>EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>For isolation of free-circulating DNA from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>937556</td>
			<td>For isolation of free-circulating DNA from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAsymphony SP system</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001297</td>
			<td>fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td>For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX100 or QX200 reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3003 or186-4003, respectively</td>
			<td>The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX100 or QX200 droplet generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3002 or 186-4002, respectively</td>
			<td>Instrument used for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td>Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>181-4000</td>
			<td>PX1&#8482; PCR plate sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge holder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3051</td>
			<td>Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartridges and gaskets</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-4007</td>
			<td>Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3010</td>
			<td>ddPCR supermix for probes (no dUTP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020362</td>
			<td>96-well semi-skirted plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>181-4040</td>
			<td>Pierceable foil heat seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3004</td>
			<td>oil used in the read</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3005</td>
			<td>oil for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.051</td>
			<td>Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex I cfDNA Reference Standard Set</td>
			<td>HORIZON</td>
			<td>HD780</td>
			<td>The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&#181;L to 100 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Qubit assay tubes are 500 &#181;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single droplet digital polymerase chain reaction for comprehensive and simultaneous detection of mutations in hotspot regions

Droplet digitale Polymerase-Kettenreaktion (DdPCR) ist eine hochempfindliche quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Methode basiert auf Probe Fraktionierung in Tausende von nanogrösse Wasser-in-Öl-individuelle Reaktionen. Vor kurzem, ist eines der genauesten und sensible Instrumente für zirkulierenden Tumor DNA (CtDNA) Erkennung DdPCR geworden. Die wesentlichen Einschränkungen der standard DdPCR-Technik gehört die begrenzte Anzahl von Mutationen, die pro Reaktion gezeigt werden kann als spezifische Hydrolyse Sonden erkennen jede mögliche Allele Version erforderlich sind. Eine alternative Methode, die Drop-off-DdPCR erhöht den Durchsatz, da es nur ein einzelnes Paar von Sonden erfordert zu erkennen und zu quantifizieren, potenziell alle genetische Veränderungen in der gezielten Region. Drop-off-DdPCR zeigt vergleichbare Sensitivität zu konventionellen DdPCR Assays mit dem Vorteil eine größere Anzahl von Mutationen in einer einzelnen Reaktion zu erkennen. Es ist kostengünstig, schont wertvolle Probenmaterial und kann auch als ein Discovery-Tool verwendet werden, wenn Mutationen kein-prioribekannt sind.

In einem Proof-of-Concept-Studie wurden KRAS Exon 2 Mutationen (Codon 12 und 13) und EGFR Exon 19 Löschungen in FFPE Gewebe und Plasma-Proben von Krebspatienten mit der Drop-off DdPCR Strategie6untersucht.
Die KRAS -Drop-off-Sonde verhört einen 16 bp-Region umfasst mehrere Mutationen im Exon 2 des KRAS -Gens, die mehr als 95 % der bekannten KRAS -Mutationen i...

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Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere genetische Veränderungen der Zielregion in einer einzelnen Reaktion mit Drop-off-DdPCR und ein einzigartiges paar Hydrolyse Sonden genau zu quantifizieren.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Diese Methode kann als diagnostisches Werkzeug für Krebs verwendet werden, um die zirkulierende Tumor-DNA zu analysieren. Diese Technik hinterfragt mehrere genetische Veränderungen in Regionen von Clustermutationen in einer einzigen Reaktion. Dies hilft, wertvolle Patientenproben zu speichern.Diese Methode kann Einblicke in die Tumorbelastung ihres Mutationsprofils geben. Es kann nun auch auf eine molekulare Analyse als Alternative zu qPCR angewendet werden, um eine absolute Quantifizierung von Nukleinsäure-Zielsequenzen zu erhalten. Sammeln Sie Blutproben in 7-Milliliter EDTA-Röhren.Zwei Röhren werden empfohlen, um etwa vier Milliliter Plasma zu sammeln. Zentrifuge die Blutproben für 10 Minuten bei 820-facher Schwerkraft innerhalb von drei Stunden nach der Blutentnahme, um rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und Plasma zu trennen. Die Zeit zwischen der Probenahme und der Zentrifugation ist entscheidend, um hochwertige, T-Zell-freie DNA zu erhalten, die nicht mit DNA kontaminiert ist, die aus weißen Blutkörperchen freigesetzt wird.Verwenden Sie nach der Zentrifugation eine serologische Pipette, um den Überstand zu sammeln, ohne die weiße Blutkörperchenschicht zu berühren. Etwa zwei Milliliter Plasma werden in der Regel pro EDTA-Röhre zurückgewonnen. Nach der Übertragung der Plasmen auf zwei Milliliter-Röhren zentrieren Sie die Aliquots bei 16.000-facher Schwerkraft für 10 Minuten bei 15 Grad Celsius, um Zellablagerungen zu entfernen.Sammeln Sie das Plasma sorgfältig, ohne das Pellet zu stören und in zwei Milliliter kryogene Röhren zu übertragen. Bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis es nötig ist. Beginnen Sie mit 400 Mikroliter Proteinase K zu einer 50-Milliliter-Röhre.Fügen Sie dann vier Milliliter Plasma und 3,2 Milliliter ACL-Lysepuffer hinzu, der ein Mikrogramm Träger-RNA aus dem Extraktionskit enthält. Schließen Sie das Rohr und mischen Sie es, indem Sie 30 Sekunden lang wirbeln, um eine homogene Lösung zu erhalten. Dann bei 60 Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren.Nach der Inkubation 7,2 Milliliter Puffer ACB in das Lysat geben, um die Bindung der zirkulierenden Nukleinsäuren an die Kieselsäuremembran zu optimieren. Mischen Sie durch Wirbel für 15 bis 30 Sekunden. Dann inkubieren Sie die Röhre für fünf Minuten auf Eis.Befestigen Sie die Säule und den 20-Milliliter-Extender an der Vakuumpumpe. Schließen Sie die nicht verwendeten Abschnitte, um Vakuumaspiration zu ermöglichen. Nach einer kurzen Zentrifugierung des Rohres, führen Sie das Gemisch vorsichtig in den Rohrverlängerer ein.Schalten Sie dann die Vakuumpumpe ein und lassen Sie das Lysat vollständig durch die Säulen ziehen. Entfernen und entsorgen Sie den Rohrverlängerer. Als Nächstes wenden Sie 600 Mikroliter Puffer ACW1 auf die Spalte an.Wenn Puffer ACW1 durch die Spalte gezogen hat, fügen Sie 750 Mikroliter ACW2-Puffer hinzu und schließlich 750 Mikroliter 96 bis 100% Ethanol. Legen Sie die Säule dann drei Minuten lang mit voller Geschwindigkeit in ein sauberes Zwei-Milliliter-Sammelrohr und eine Zentrifuge, um Ethanol zu eliminieren. Nachdem Sie die Säule in ein neues Zwei-Milliliter-Sammelrohr gestellt haben, öffnen Sie den Deckel und bebrüten dann bei 56 Grad Celsius für 10 Minuten, um die Membran vollständig zu trocknen.Legen Sie die Säule nach der Inkubation in ein sauberes 1,5 Milliliter-Bindungsrohr. 36 Mikroliter RNase-freies Wasser mit 0,04%Natriumazid vorsichtig auftragen. Schließen Sie dann den Deckel und bebrüten bei Raumtemperatur drei Minuten lang.Zentrifugieren Sie wieder mit voller Geschwindigkeit für eine Minute, um die Nukleinsäuren zu elute. Dann bei negativen 20 Grad Celsius lagern, bis nötig. Beginnen Sie mit dem Auftauen und Ausgleichen der Reaktionskomponenten auf Raumtemperatur in einer sauberen PCR-Haube.Bereiten Sie dann eine 20-fache Mischung aus Primern und Sonden in RNase und Dnase-freiem destilliertem Wasser mit jeder Grundierung bei 18 Mikromolarkonzentration und jeder Sonde mit fünf Mikromolarkonzentration vor. Für alle einzelnen PCR-Reaktionen bereiten Sie einen Probenmix vor, indem Sie 10 Mikroliter des zweifachen ddPCR Supermix, einen Mikroliter mit 20-fachen Primern und Sonden und bis zu 10 Nanogramm der DNA-Probe in 20 Mikroliter destilliertem Wasser kombinieren. Wirbeln Sie das Reaktionsgemisch gründlich, um Homogenität zu gewährleisten.Und kurz Zentrifuge, um Inhalt an der Unterseite des Rohres vor dem Dosieren zu sammeln. Setzen Sie die ddPCR-Patrone in den Halter ein und laden Sie 20 Mikroliter Probenreaktionsmischung in die mittleren Brunnen der Patrone für die Tröpfchenerzeugung. Fügen Sie 70 Mikroliter Tröpfchengeneratoröl in die unteren Brunnen.Setzen Sie die Patrone mit einer Dichtung in den Tröpfchengenerator ein. Tröpfchen werden in den oberen Brunnen der Patrone hergestellt. Langsam und schonend 40 Mikroliter der Tröpfchen aus den Kartuschen absaugen und in eine 96-Well-PCR-Platte geben.Versiegeln Sie die endgültige PCR-Platte mit Aluminiumfolie mit einem Plattenversiegeler unmittelbar nach dem Übertragen von Tröpfchen, um Verdunstung zu vermeiden. Kurz zentrifugieren Sie die Platte, um Denkinhalt an der Unterseite der Brunnen zu sammeln. Führen Sie eine herkömmliche PCR-Verstärkung auf einem thermischen Cycler aus.Wenn der Lauf abgeschlossen ist, zentrieren Sie die Platte kurz, um den Inhalt an der Unterseite der Brunnen zu sammeln. Verwenden Sie nach der PCR-Verstärkung den Tröpfchenleser, um PCR-positive und PCR-negative Tröpfchen gemäß den Anweisungen des Herstellers zu zählen. Im Folgenden finden Sie repräsentative Ergebnisse, die während der Optimierungsschritte des Drop-off-ddPCR-Assays erzielt wurden.Dieses Bild zeigt den Nachweis von mutierter DNA und Wild-DNA in einer Reaktion, die 100% mutierte DNA, 5% mutierte DNA und 100% Wilde-DNA enthält. Dieses Bild zeigt Beispiele von Plasmaproben, die mit den KRAS- und EGFR-Drop-off-ddPCR-Assays analysiert wurden, die den Nachweis von Einzelnukleotid und Mehrfachsubstitutionen in Exon zwei von KRAS und eine Deletion in EGFR exon 19 zeigen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, bei jedem Schritt sorgfältig mit einer besonderen Aufmerksamkeit bei der Tröpfchengenerierung vorzugehen, was ein kritischer Schritt dieser Methode ist.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik forschern und Klinikern auf dem Gebiet der Krebsforschung den Weg zur Optimierung der Tumormutationsanalyse mittels flüssiger Biopsie.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

DNA, Cells, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP Genotypisierung von Toxic Kugelfisch durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Forschung

Genetik

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

Der Visual kolorimetrischen Nachweis von Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einem pneumatischen Droplet Manipulation Platform

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Bewertung einer universellen, veralteten Transcription Polymerase Chain Reaction zur Erkennung von Lyssaviren

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...