Name: single droplet digital polymerase chain reaction for comprehensive and simultaneous detection of mutations in hotspot regions
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00
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Questo lavoro è stato supportato da Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). Gli autori desiderano ringraziare Caroline Hego per il suo contributo al video.

Il protocollo presentato qui segue le linee guida di etica dell'Institut Curie. Tutti i campioni umani sono stati ottenuti da pazienti arruolati, previo consenso informato, in studi approvati dalla Institutional Review Board presso Institut Curie.
1. raccolta, conservazione di Plasma ed estrazione di DNA libero di sangue
Nota: Può essere utilizzato DNA Estratto da qualsiasi tipo di "tessuto" (ad es., fresco o formaldeide-fisso paraffina embedded tessuti (FFP...

<ol>
	<li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Amado, R. G., Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-Type+KRAS+Is+Required+for+Panitumumab+Efficacy+in+Patients+With+Metastatic+Colorectal+Cancer.">Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).</li><li>Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-ras+mutations+and+benefit+from+cetuximab+in+advanced+colorectal+cancer.">K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer.</a> New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).</li><li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA:+a+cancer+diagnostic+perspective.">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li><li>Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+for+triple-negative+breast+cancer+diagnosis+and+treatment+decisions.">Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).</li><li>Decraene, C., Silveira, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Hotspot+Mutations+Scanning+by+Single+Droplet+Digital+PCR.">Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR.</a> Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).</li><li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).</li><li>Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+Comprises+an+In+Vivo+Nucleosome+Footprint+that+Informs+Its+Tissues-Of-Origin.">Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.</a> Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).</li><li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay.">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li><li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddpcr:+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data.">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COSMIC:+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution.">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li></ol>

Per progettare un'analisi ddPCR di consegna efficiente, ottimizzazione è fondamentale, e il protocollo deve essere seguito attentamente. Ogni combinazione di primer e sonde ha un unico efficienza di reazione di PCR. Pertanto, un'analisi individuale deve essere convalidato con attenzione su campioni di controllo prima di essere utilizzati su campioni di prova importante. Ottimizzazione e validazione sono importanti per certificare il rilevamento del segnale di picco e valutare la sensibilità e specificità. Come descrit...

Migliaia di mutazioni somatiche legate allo sviluppo del cancro è stati segnalati1. Tra questi, alcuni sono marcatori predittivi dell'efficacia della terapia mirata 2,3 e la selezione di queste mutazioni genetica è pratica clinica di routine in questo momento. Tecnologia digitale di PCR (ddPCR) della gocciolina può essere utilizzata per monitorare la presenza o l'assenza di mutazioni con elevata accuratezza ed è altamente compatibile con biopsie liquido invasivo4,5. Tuttavia, la corrente ddPCR saggi sono progettati principalmente per rilevare mutazioni conosciute a priori. Questo limita fortemente l'uso di ddPCR come uno strumento di scoperta quando la mutazione è sconosciuta. Infatti, nella progettazione convenzionale ddPCR, una sonda di idrolisi riconoscendo l'allele wild-type (WT sonda) compete con una sonda specifica per riconoscere l'allele del mutante (MUT sonda) (Figura 1A). La sonda con maggiore affinità ibridizza con il modello e rilascia il fluoroforo, che indica la natura dell'allele corrispondente. I dati di fluorescenza ottenuti per ciascuna gocciolina possono essere visualizzati in un grafico a dispersione che rappresenta la fluorescenza emessa dalle sonde WT e MUT in diverse dimensioni. Una rappresentazione schematica di un risultato tipico per un dosaggio di ddPCR convenzionale è presentata in Figura 1A. In questo esempio, la nuvola blu corrisponde alle goccioline contenenti alleli WT identificati dalla sonda WT, mentre la nuvola rossa corrisponde a goccioline in cui l'allele MUT è stato amplificato e identificato dalla sonda MUT. A seconda della quantità di DNA caricato nella reazione, doppie positive goccioline contenenti sia WT e MUT ampliconi possono apparire (nuvola verde). La nuvola grigia luce corrisponde a goccioline vuote.
Poiché la maggior parte delle piattaforme consentono la rilevazione di un numero limitato di fluorofori (solitamente 2, ma fino a 5), velocità effettiva di ddPCR convenzionale è limitata. Targeting per regioni con mutazioni multiple adiacenti richiede pertanto, progettazione di tecnicamente impegnativi saggi multiplex ddPCR o l'utilizzo di reazioni multiple targeting ogni mutazione in parallelo. La strategia di ddPCR di drop-off, supera questa limitazione come potenzialmente può rilevare qualsiasi alterazione genetica all'interno di un'area di destinazione utilizzando un unico paio di WT idrolisi sonde. Le prime coperture di sonda (sonda 1) una sequenza non variabile, adiacente alla regione di destinazione e la seconda sonda (sonda 2) è complementare alla sequenza WT della regione di destinazione, dove le mutazioni sono attesi (Figura 1B). Mentre la prima sonda quantifica la quantità totale di molecole amplificabile nella reazione, la seconda sonda discrimina gli alleli WT e MUT tramite l'ibridazione sub-ottima alle sequenze mutanti. Sonda 2 può identificare diversi tipi di mutazioni in destinazione regione (sostituzioni nucleotidiche singole o multiple, cancellazione, ecc.)6. Come ddPCR convenzionale, la nuvola grigia luce corrisponde a goccioline non contenenti nessun molecole di DNA. È importante ricordare che in questo tipo di analisi, una ottimale separazione delle nuvole WT e MUT è dipenda dalla quantità di DNA caricato nella reazione, dal momento che le goccioline contenenti sia WT e MUT alleli di destinazione non possono essere distinto da goccioline contenenti solo il WT modulo. Pertanto, questo test richiede che la maggior parte delle goccioline contengono non più di una copia del gene mirato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K2EDTA tube (color code : lavender)</td>
			<td>BD</td>
			<td>367863</td>
			<td>EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>For isolation of free-circulating DNA from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>937556</td>
			<td>For isolation of free-circulating DNA from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAsymphony SP system</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001297</td>
			<td>fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td>For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX100 or QX200 reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3003 or186-4003, respectively</td>
			<td>The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX100 or QX200 droplet generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3002 or 186-4002, respectively</td>
			<td>Instrument used for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td>Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>181-4000</td>
			<td>PX1&#8482; PCR plate sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge holder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3051</td>
			<td>Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartridges and gaskets</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-4007</td>
			<td>Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3010</td>
			<td>ddPCR supermix for probes (no dUTP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020362</td>
			<td>96-well semi-skirted plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>181-4040</td>
			<td>Pierceable foil heat seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3004</td>
			<td>oil used in the read</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3005</td>
			<td>oil for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.051</td>
			<td>Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex I cfDNA Reference Standard Set</td>
			<td>HORIZON</td>
			<td>HD780</td>
			<td>The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&#181;L to 100 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Qubit assay tubes are 500 &#181;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single droplet digital polymerase chain reaction for comprehensive and simultaneous detection of mutations in hotspot regions

Reazione a catena della polimerasi digitale gocciolina (ddPCR) è un metodo di reazione a catena (PCR) altamente sensibile della polimerasi quantitativa basato sul frazionamento del campione in migliaia di dimensioni nano reazioni individuali di acqua in olio. Recentemente, ddPCR è diventato uno degli strumenti più precisi e sensibili per la rilevazione di DNA (ctDNA) del tumore di circolazione. Uno dei principali limiti della tecnica standard ddPCR è il limitato numero di mutazioni che possono essere sottoposti a screening per reazione, come sonde specifiche idrolisi riconoscendo ogni possibile versione alleliche sono necessari. Una metodologia alternativa, il ddPCR di drop-off, aumenta il throughput, poiché richiede solo una singola coppia di sonde per rilevare e quantificare potenzialmente tutte le alterazioni genetiche dalla regione di destinazione. Drop-off ddPCR Visualizza sensibilità paragonabile ai saggi di ddPCR convenzionale con il vantaggio di rilevare un maggior numero di mutazioni in una singola reazione. È conveniente, conserva materiale prezioso campione e può essere utilizzato anche come strumento di scoperta, quando le mutazioni non sono noti a priori.

In uno studio di proof-of-concept, mutazioni di KRAS esone 2 (codoni 12 e 13) ed EGFR esone 19 delezioni sono stati studiati nei tessuti FFPE e campioni di plasma dai malati di cancro utilizzando il drop-off ddPCR strategia6.
La sonda di drop-off KRAS interrogato una regione di bp 16 comprendente più mutazioni nell'esone 2 del gene KRAS , che oltre il 95% delle mutazio...

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Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le alterazioni genetiche multiple di una regione di destinazione in una singola reazione usando drop-off ddPCR e un paio di idrolisi sonde uniche.

Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Questo metodo può essere utilizzato come strumento diagnostico per il cancro per analizzare il DNA tumorale circolante. Questa tecnica interroga l'alterazione genetica multipla nelle regioni di mutazioni a grappolo in una singola reazione. Questo aiuta a salvare preziosi campioni di pazienti.Questo metodo può fornire informazioni sul carico tumorale sul suo profilo mutazionale. Ora può anche essere applicato ad un'analisi molecolare come alternativa al qPCR per ottenere una quantificazione assoluta delle sequenze bersaglio dell'acido nucleico. Raccogliere campioni di sangue in tubi EDTA da sette millilitri.Si consiglia a due tubi di raccogliere circa quattro millilitri di plasma. Centrifugare i campioni di sangue per 10 minuti a 820 volte la gravità entro tre ore dall'estrazione del sangue per separare globuli rossi, globuli bianchi e plasma. Il tempo tra il campionamento e la centrifugazione è fondamentale per ottenere DNA di alto grado e privo di cellule T non contaminato dal DNA rilasciato dai globuli bianchi.Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere il supernatante senza toccare lo strato di globuli bianchi. Circa due millilitri di plasma vengono solitamente recuperati per tubo EDTA. Dopo aver trasferito i plasmi in due tubi millilitro, centrifugare le aliquote a 16.000 volte la gravità per 10 minuti a 15 gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari.Raccogliere con cura il plasma senza disturbare il pellet e trasferirlo in due tubi criogenici millilitri. Conservare a -80 gradi Celsius fino a quando necessario. Inizia aggiungendo 400 microlitri di proteinasi K a un tubo da 50 millilitri.Quindi, aggiungere quattro millilitri di plasma e 3,2 millilitri di tampone di lisi ACL contenente un microgrammo di RNA portante dal kit di estrazione. Chiudere il tubo e mescolare vortici per 30 secondi per ottenere una soluzione omogenea. Quindi, incubare a 60 gradi Celsius per 30 minuti.Dopo l'incubazione, aggiungere 7,2 millilitri di tampone ACB al lisato per ottimizzare il legame degli acidi nucleici circolanti alla membrana silicea. Mescolare con vortice per 15-30 secondi. Quindi, incubare il tubo sul ghiaccio per cinque minuti.Attaccare la colonna e l'estensore da 20 millilitri alla pompa per vuoto. Chiudere le porzioni inutilizzate per consentire l'aspirazione del vuoto. Dopo aver centrifugato brevemente il tubo, introdurre con cura la miscela nell'estensore del tubo.Quindi accendere la pompa per vuoto e lasciare che il lisato venga disegnato completamente attraverso le colonne. Rimuovere e scartare l'estensore del tubo. Applicare quindi 600 microlitri di buffer ACW1 alla colonna.Quando il buffer ACW1 ha disegnato attraverso la colonna, aggiungere 750 microlitri di tampone ACW2 e, infine, 750 microlitri dal 96 al 100% di etanolo. Quindi, posizionare la colonna in un tubo di raccolta pulito da due millilitri e centrifugare a tutta velocità per tre minuti per eliminare l'etanolo. Dopo aver posizionato la colonna in un nuovo tubo di raccolta a due millilitri, aprire il coperchio e quindi incubare a 56 gradi Celsius per 10 minuti per asciugare completamente la membrana.Dopo l'incubazione, posizionare la colonna in un tubo pulito a bassa legatura da 1,5 millilitri. Applicare con cura 36 microlitri di acqua priva di RNasi con azide di sodio dello 0,04%. Quindi, chiudere il coperchio e incubare a temperatura ambiente per tre minuti.Centrifugare di nuovo a tutta velocità per un minuto per elutare gli acidi nucleici. Quindi, conservare a -20 gradi Celsius fino a quando necessario. Iniziare scongelando ed equilibrando i componenti di reazione a temperatura ambiente in una cappa PCR pulita.Quindi preparare un mix 20 volte di primer e sonde in acqua distillata priva di RNasi e Dnase con ogni primer a concentrazione micromolare 18 e ogni sonda a cinque concentrazione micromolare. Per tutte le singole reazioni PCR, preparare un mix di campioni combinando 10 microlitri di supermix ddPCR due volte, un microlitro di 20 volte primer e sonde mixare e fino a 10 nanogrammi del campione di DNA in 20 microlitri di acqua distillata. Vortice la miscela di reazione accuratamente per garantire omogeneità.E centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto nella parte inferiore del tubo prima di erogare. Inserire la cartuccia ddPCR nel supporto e caricare 20 microlitri di miscela di reazione del campione nei pozzi centrali della cartuccia per la generazione di goccioline. Aggiungere 70 microlitri di olio generatore di goccioline nei pozzi inferiori.Inserire la cartuccia con una guarnizione nel generatore di goccioline. Le goccioline saranno prodotte nei pozzi superiore della cartuccia. Aspirare lentamente e delicatamente 40 microlitri delle goccioline dalle cartucce e erogare in una piastra PCR da 96 po'.Sigillare la piastra PCR finale con un foglio di alluminio utilizzando un sigillante a piastre immediatamente dopo il trasferimento delle goccioline per evitare l'evaporazione. Centrifugare brevemente la piastra per raccogliere il contenuto nella parte inferiore dei pozzi. Eseguire un'amplificazione PCR convenzionale su un ciclore termico.Al termine della corsa, centrifugare brevemente la piastra per raccogliere il contenuto nella parte inferiore dei pozzi. Dopo l'amplificazione PCR, utilizzare il lettore di goccioline per contare le goccioline positive PCR e PCR negative seguendo le istruzioni del produttore. Di seguito sono riportato i risultati rappresentativi ottenuti durante le fasi di ottimizzazione del saggio ddPCR drop-off.Questa immagine mostra il rilevamento del DNA mutante e del DNA di tipo selvatico in una reazione contenente il 100% di DNA mutante, il 5% di DNA mutante e il DNA al 100% di tipo selvaggio. Questa immagine mostra esempi di campioni di plasma analizzati con i test ddPCR drop-off KRAS ed EGFR che mostrano il rilevamento di singoli nucleotidi e sostituzioni multiple nell'esone due di KRAS e una cancellazione nell'esone 19 EGFR. Durante il tentativo di questa procedura, è importante procedere con attenzione in ogni passaggio con un'attenzione speciale alla generazione di goccioline, che è un passaggio critico di questo metodo.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada a ricercatori e clinici nel campo della ricerca sul cancro per ottimizzare l'analisi delle mutazioni tumorali utilizzando la biopsia liquida.

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