Name: single droplet digital polymerase chain reaction for comprehensive and simultaneous detection of mutations in hotspot regions
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00
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이 작품은 인 퀴리 SiRIC (그랜트 잉카-DGOS-4654)에 의해 지원 되었다. 저자 또한 비디오에 그녀의 기여에 대 한 캐롤라인 Hego을 감사 하고자 합니다.

여기에 제시 된 프로토콜 인 퀴리의 윤리 지침을 따릅니다. 모든 인간의 샘플 동의 연구 인 퀴리에 기관 검토 위원회에 의해 승인 후 등록 환자에서 얻은 했다.
1. 혈액 수집, 플라즈마 저장 및 셀 무료 DNA 추출
참고: 모든 유형의 "조직"에서 추출한 DNA를 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 신선한 또는 포름알데히드 고정 파라핀 (FFPE) 조직, 문화 또는 혈액...

<ol>
	<li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Amado, R. G., Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-Type+KRAS+Is+Required+for+Panitumumab+Efficacy+in+Patients+With+Metastatic+Colorectal+Cancer.">Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).</li><li>Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-ras+mutations+and+benefit+from+cetuximab+in+advanced+colorectal+cancer.">K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer.</a> New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).</li><li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA:+a+cancer+diagnostic+perspective.">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li><li>Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+for+triple-negative+breast+cancer+diagnosis+and+treatment+decisions.">Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).</li><li>Decraene, C., Silveira, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Hotspot+Mutations+Scanning+by+Single+Droplet+Digital+PCR.">Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR.</a> Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).</li><li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).</li><li>Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+Comprises+an+In+Vivo+Nucleosome+Footprint+that+Informs+Its+Tissues-Of-Origin.">Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.</a> Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).</li><li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay.">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li><li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddpcr:+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data.">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COSMIC:+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution.">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li></ol>

효율적인 감소 ddPCR 분석 결과, 디자인에 최적화는 중요 한, 그리고 프로토콜을 신중 하 게 따라야 합니다. 뇌관 및 프로브 각 조합의 고유 PCR 반응 효율이 있다. 따라서, 개별 분석 결과 신중 하 게 유효성을 검사할 컨트롤 샘플에 귀중 한 테스트 샘플에 사용 되 고 있다. 최적화 및 유효성 검사 증명 피크 신호 검출 및 특이성 및 감도 평가에 중요 하다. 프로토콜에 설명 된 대로 모든 돌연변이 "프로...

암 개발에 관련 된 체세포 돌연변이의 수천 보고 된1되었습니다. 이 중, 몇 가지 예측 마커 타겟된 치료 2,3 의 효능 이며 상영이 돌연변이의 유전은 이제 일상적인 임상 연습. 드롭릿 디지털 PCR (ddPCR) 기술은 높은 검색 정확도로 유무의 변이 대 한 모니터링에 사용할 수 고 매우 비 침략 적 액체 biopsies4,5와 호환 합니다. 그러나, 현재 ddPCR 분석 실험은 주로 선험적으로알려진 돌연변이 감지 하도록 설계 되었습니다. 이 심각 하 게 돌연변이 알 수 없는 경우 검색 도구로 ddPCR 사용 하 여를 제한 합니다. 실제로, 기존의 ddPCR 디자인, 야생 형 대립 유전자 (WT 프로브)를 인식 하는 가수분해 프로브 인식 하는 돌연변이 체 대립 유전자 (MUT 프로브) (그림 1A) 특정 조사와 경쟁 한다. 높은 선호도 조사 서식 파일을 hybridizes 하 고 해당 대립 유전자의 성격을 나타내는 그것의 fluorophore를 해제 합니다. 각 작은 물방울에 대 한 얻은 형광 데이터 WT 및 MUT 프로브 다른 차원에 의해 방출 하는 형광을 나타내는 산 점도에 구상 될 수 있다. 기존의 ddPCR 분석 결과 대 한 일반적인 결과의 도식 표현 그림 1A에 제공 됩니다. 이 예제에서는 블루 클라우드 빨간 구름 방울 있는 MUT 대립 유전자 증폭 되었고 MUT 프로브에 의해 식별에 해당 하는 반면 WT 프로브로 식별 하는 WT 대립 유전자를 포함 하는 작은 물방울에 해당 합니다. 반응에서 로드 하는 DNA의 양에 따라서 WT와 MUT amplicons 포함 된 더블 긍정적인 방울 (녹색 구름) 나타날 수 있습니다. 빛 회색 구름 빈 물방울에 해당합니다.
대부분의 플랫폼 fluorophores (보통 2, 최대 5만)의 제한 된 수의 검출에 대 한 허용, 기존의 ddPCR의 처리량 제한 됩니다. 따라서, 여러 개의 인접 한 돌연변이와 영역을 대상으로 기술적으로 도전적인 멀티플렉스 ddPCR 분석 실험 또는 동시에 각 돌연변이 대상으로 하는 여러 반응의 사용의 디자인을 필요 합니다. 그것은 잠재적으로 독특한 WT 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 대상 지역 내에서 어떤 유전 변경 감지 수 있습니다 드롭 ddPCR 전략이이 제한 극복. 첫 번째 프로브 (Probe 1) 커버 비 변수 시퀀스, 대상 지역 및 두 번째 프로브 (Probe 2)은 돌연변이 대상 영역의 WT 시퀀스에 보완 예정 (그림 1B). 첫번째 조사 반응에 amplifiable 분자의 총 금액을 단정, 하는 동안 두 번째 프로브 WT 및 MUT 대립 유전자 돌연변이 시퀀스에 최적의 교 잡에 의해 차별. 프로브 2 대상 지역 (단일 또는 여러 개의 뉴클레오티드 대체, 삭제, 등)6에 돌연변이의 여러 종류를 식별할 수 있습니다. 기존의 ddPCR에서 빛 회색 구름 없는 DNA 분자를 포함 하는 작은 물방울에 해당 합니다. 이 유형의 분석 결과에 WT MUT 구름의 최적의 분리는 DNA WT와 MUT 대상 대립 유전자를 포함 하는 작은 물방울만 WT를 포함 하는 작은 물방울에서 구분할 수 없습니다 이후 반응, 로드의 수량에 따라 기억 하는 것이 중요 하다 양식입니다. 따라서,이 분석 결과 대부분 물방울 타겟된 유전자의 둘 이상의 복사본을 포함 해야 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K2EDTA tube (color code : lavender)</td>
			<td>BD</td>
			<td>367863</td>
			<td>EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>For isolation of free-circulating DNA from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>937556</td>
			<td>For isolation of free-circulating DNA from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAsymphony SP system</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001297</td>
			<td>fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td>For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX100 or QX200 reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3003 or186-4003, respectively</td>
			<td>The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX100 or QX200 droplet generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3002 or 186-4002, respectively</td>
			<td>Instrument used for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td>Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>181-4000</td>
			<td>PX1&#8482; PCR plate sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge holder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3051</td>
			<td>Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartridges and gaskets</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-4007</td>
			<td>Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3010</td>
			<td>ddPCR supermix for probes (no dUTP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020362</td>
			<td>96-well semi-skirted plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>181-4040</td>
			<td>Pierceable foil heat seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3004</td>
			<td>oil used in the read</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3005</td>
			<td>oil for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.051</td>
			<td>Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex I cfDNA Reference Standard Set</td>
			<td>HORIZON</td>
			<td>HD780</td>
			<td>The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&#181;L to 100 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Qubit assay tubes are 500 &#181;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single droplet digital polymerase chain reaction for comprehensive and simultaneous detection of mutations in hotspot regions

드롭릿 디지털 연쇄 반응 (ddPCR)은 나노 크기의 물에서 기름 개별 반응의 수천에 샘플 분류에 따라 매우 민감한 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법. 최근에, ddPCR는 순환 종양 DNA (ctDNA) 검색에 대 한 가장 정확 하 고 중요 한 도구 중 하나가 되고있다. 표준 ddPCR 기술의 주요 한계 중 하나는 각 가능한 유전자 버전을 인식 하는 특정 가수분해 프로브는 필요 반응, 당 상영 될 수 있는 돌연변이의 제한 수입니다. 다른 방법론, 드롭 오프 ddPCR만 한 쌍의 프로브를 감지 하 여 잠재적으로 모든 유전 변경 대상된 지역에서 계량 하므로 처리량을 증가 합니다. 드롭 오프 ddPCR 단일 반응에서 돌연변이의 더 많은 수를 감지의 장점과 함께 기존의 ddPCR 분석 실험에 유사한 감도 표시 합니다. 그것은 비용 효율적인, 귀중 한 시료를 보존 이며 또한 경우 사용할 수 있습니다 검색 도구로 돌연변이 선험적으로알려져 있지 않습니다.

개념 증명 연구에서 KRA exon 2 돌연변이 (codons 12, 13)와 EGFR exon 19 삭제 FFPE 직물 및 드롭 오프 ddPCR 전략6을 사용 하 여 암 환자에서 혈장 샘플에 조사 되었다.
KRA 이탈 프로브 심문 알려진된 KRA 돌연변이 인간 암11의 95% 이상 항구는 KRA 유전자의 엑손 2에서에서 ?...

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Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

여기, 우리는 정확 하 게 계량 드롭 ddPCR 독특한 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 단일 반응에서 대상 지역의 여러 유전 변경 하는 프로토콜을 제시.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

이 방법은 순환 종양 DNA를 분석하기 위한 암진단 도구로 사용될 수 있다. 이 기술은 단 하나 반응에 있는 클러스터 돌연변이의 지구에 있는 다중 유전 변경을 심문합니다. 이것은 귀중한 참을성 있는 견본을 저장하는 것을 돕습니다.이 방법은 그것의 돌연변이 단면도에 종양 부담에 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 핵산 표적 서열의 절대정량화를 얻기 위해 qPCR에 대한 대안으로서 분자 분석에 적용될 수 있다. 7 밀리리터 EDTA 튜브에서 혈액 샘플을 수집합니다.2개의 관은 플라즈마의 약 4밀리리터를 수집하는 것이 좋습니다. 혈액 시료를 820배의 중력에서 10분 동안 원심분리하여 적혈구, 백혈구 및 혈장분리를 유도합니다. 샘플링과 원심 분리 사이의 시간은 백혈구에서 방출되는 DNA로 오염되지 않은 고급 T 세포없는 DNA를 얻는 데 중요합니다.원심 분리에 따라, 백혈구 층을 만지지 않고 상체피수집을 위해 서학적 파이펫을 사용합니다. 플라즈마의 약 2 밀리리터는 일반적으로 EDTA 튜브 당 복구됩니다. 플라스를 2밀리리터 튜브로 옮김한 후, 16번, 000배의 중력을 15도에서 10분 동안 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다.조심스럽게 펠릿을 방해하지 않고 플라즈마를 수집하고 두 밀리리터 극저온 튜브로 전송합니다. 필요할 때까지 음수 섭씨 80도에 보관하십시오. 50 밀리리터 튜브에 400 마이크로리터의 단백질제 K를 첨가하십시오.이어서, 추출 키트로부터 1마이크로그램의 담체 RNA를 함유하는 플라즈마 4밀리리터와 ACL 리시스 버퍼 3.2 밀리리터를 첨가한다. 튜브를 닫고 30초 동안 소용돌이를 통해 혼합하여 균질성 용액을 얻습니다. 그런 다음 섭씨 60도에서 30 분 동안 배양하십시오.인큐베이션 후, 리세이트에 완충ACB7.2 밀리리터를 추가하여 실리카 멤브레인에 순환하는 핵산의 결합을 최적화한다. 15~30초 동안 소용돌이에 섞으세요. 그런 다음 5 분 동안 얼음에 튜브를 배양합니다.컬럼과 20밀리리터 익스텐더를 진공 펌프에 부착합니다. 사용하지 않은 부분을 닫아 진공 포부를 허용합니다. 튜브를 잠시 원심분리한 후 튜브 익스텐더에 혼합물을 조심스럽게 도입하십시오.그런 다음 진공 펌프를 켜고 용하가 열을 통해 완전히 그려질 수 있도록 합니다. 튜브 익스텐더를 제거하고 폐기합니다. 다음으로 600마이크로리터의 버퍼 ACW1을 열에 적용합니다.버퍼 ACW1이 컬럼을 통해 그려지면 ACW2 버퍼750 마이크로리터를 추가하고 마지막으로 96~100%의 마이크로리터 750을 추가합니다. 그런 다음 열을 깨끗한 2 밀리리터 수집 튜브와 원심분리기를 3분 동안 최고 속도로 배치하여 에탄올을 제거합니다. 컬럼을 새로운 2밀리리터 수집 튜브에 넣은 후 뚜껑을 열고 섭씨 56도에서 10분 동안 배양하여 멤브레인을 완전히 건조시킵니다.인큐베이션 후 컬럼을 깨끗한 1.5 밀리리터 저결합 튜브에 넣습니다. 0.04%의 나트륨 아지드를 장착한 RNase 가 없는 물 36마이크로리터를 조심스럽게 적용하십시오. 그런 다음 뚜껑을 닫고 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.핵산을 털어내려면 1분 동안 다시 최고 속도로 원심분리기를 합니다. 그런 다음 필요할 때까지 음수 섭씨 20도에 보관하십시오. 먼저 반응 성분을 깨끗한 PCR 후드의 실온에 해빙하고 평형화합니다.그런 다음 RNase 및 Dnase 프리 증류수에서 프라이머와 프로브를 20배 혼합하여 각 프라이머를 18 마이크로몰라 농도로, 각 프로브는 5개의 마이크로몰라 농도로 준비합니다. 모든 개별 PCR 반응의 경우, 2회 ddPCR 슈퍼믹스10마이크로리터, 프라이머 와 프로브 믹스 20배의 마이크로리터 1개, 증류수 20마이크로리터에 DNA 샘플의 최대 10나노그램을 결합하여 샘플 믹스를 준비한다. 균질성을 보장하기 위해 반응 혼합물을 철저히 소용돌이시다.그리고 간략하게 원심분리기를 분배하기 전에 튜브 의 바닥에 있는 내용을 수집합니다. ddPCR 카트리지를 홀더에 삽입하고 20 마이크로리터의 샘플 반응 믹스를 카트리지의 중간 우물에 적물물 생성을 할 수 있습니다. 70 마이크로리터의 액적 발생기 오일을 하단 우물에 넣습니다.개스킷이 있는 카트리지를 물방울 발생기에 삽입합니다. 물방울은 카트리지의 상단 우물에서 생산됩니다. 카트리지에서 40 마이크로리터를 천천히 부드럽게 흡인시키고 96웰 PCR 플레이트에 분배합니다.증발을 피하기 위해 물방울을 옮은 직후 플레이트 실러를 사용하여 알루미늄 호일로 최종 PCR 플레이트를 밀봉하십시오. 우물 바닥에 있는 내용을 수집하기 위해 접시를 간단히 원심분리합니다. 열 사이클러에서 기존의 PCR 증폭을 실행합니다.달리기가 완료되면 접시를 잠시 원심분리하여 우물 바닥에 있는 내용물을 수집합니다. PCR 증폭 후, 소책자 판독기를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 PCR 양수 및 PCR 음수 방울을 계산합니다. 다음은 드롭오프 ddPCR 분석기의 최적화 단계에서 얻은 대표적인 결과입니다.이 이미지는 100% 돌연변이 DNA, 5% 돌연변이 DNA 및 100% 야생형 DNA를 포함하는 반응에서 돌연변이 DNA 및 야생형 DNA의 검출을 보여줍니다. 본 이미지는 KRAS 및 EGFR 드롭오프 ddPCR 분석으로 분석된 플라즈마 샘플의 예를 보여 주며, 단일 뉴클레오티드 및 다중 대체체의 검출을 KRAS 2의 KRAS 및 EGFR 엑슨 19에서 삭제하는 것을 나타낸다. 이 절차를 시도하는 동안 이 방법의 중요한 단계인 액적 생성에 특별한 주의를 기울여 각 단계에서 신중하게 진행하는 것이 중요합니다.개발 후, 이 기술은 액체 생검을 사용하여 종양 돌연변이 분석을 최적화하기 위하여 암 연구 분야의 연구원 그리고 임상의를 위한 도로를 포장했습니다.

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Molecular Biology

Genetics

Unit 1

DNA, Cells, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 유독 복어의 개선 중합 효소 연쇄 반응 - 제한 조각의 길이 다형성 유전자형

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

연구

유전학

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

공기 방울 조작 플랫폼에서 멀티 염기 다형성의 비주얼 색도계 감지

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: BEST1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...