Name: single droplet digital polymerase chain reaction for comprehensive and simultaneous detection of mutations in hotspot regions
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). Forfatterne vil også takke Caroline Hego for hennes bidrag til video.

Protokollen presenteres her følger etiske retningslinjene Institut Curie. Alle menneskelige prøver ble innhentet fra pasienter registrert, etter samtykke, i studier godkjent av institusjonelle Review Board på Institut Curie.
1. blod samling, Plasma lagring og Cell-free DNA utvinning
Merk: DNA utvunnet fra alle typer "tissue" kan brukes (f.eks friske eller formaldehyd-fast parafin embedded (FFPE) vev, celler i kultur-eller blod). Her gir vi detaljerte instr...

<ol>
	<li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Amado, R. G., Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-Type+KRAS+Is+Required+for+Panitumumab+Efficacy+in+Patients+With+Metastatic+Colorectal+Cancer.">Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).</li><li>Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-ras+mutations+and+benefit+from+cetuximab+in+advanced+colorectal+cancer.">K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer.</a> New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).</li><li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA:+a+cancer+diagnostic+perspective.">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li><li>Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+for+triple-negative+breast+cancer+diagnosis+and+treatment+decisions.">Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).</li><li>Decraene, C., Silveira, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Hotspot+Mutations+Scanning+by+Single+Droplet+Digital+PCR.">Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR.</a> Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).</li><li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).</li><li>Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+Comprises+an+In+Vivo+Nucleosome+Footprint+that+Informs+Its+Tissues-Of-Origin.">Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.</a> Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).</li><li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay.">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li><li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddpcr:+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data.">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COSMIC:+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution.">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li></ol>

Hvis du vil utforme en effektiv drop-off ddPCR analysen, optimalisering er avgjørende, og protokollen må følges nøye. Hver kombinasjon av primere og sonder har en unik PCR reaksjon effektivitet. Dermed har individuelle analysen godkjennes nøye på kontroll prøver før den brukes på verdifulle test prøver. Optimalisering og godkjenningen er viktig å sertifisere peak signalgjenkjenning og vurdere spesifisitet og følsomhet. Som beskrevet i protokollen, kan alle mutasjoner i et mål område dekket av "sonden 2" pot...

Tusenvis av somatiske mutasjoner knyttet til hudkreft har vært rapportert1. Blant disse, noen er prediktiv markører av effekten av målrettet terapi 2,3 og genetiske screening av disse mutasjoner er nå rutinemessige klinisk praksis. Slippverktøy digital PCR (ddPCR) teknologien kan brukes til å overvåke for tilstedeværelse eller fravær av mutasjoner med høy oppdagelsen nøyaktighet og er høyst kompatibel med ikke-invasiv flytende biopsier4,5. Imidlertid er gjeldende ddPCR analyser hovedsakelig laget for å oppdage mutasjoner kjent en priori. Dette begrenser sterkt bruk av ddPCR som et funn verktøy når mutasjon er ukjent. Faktisk i tradisjonell ddPCR design konkurrerer en hydrolyse sonde erkjenner det vill-type allelet (WT sonde) med en bestemt sonde erkjenner det muterte allelet (MUT sonde) (figur 1A). Sonde med høyere affinitet arten i malen og utgivelser sin fluorophore, som indikerer det tilsvarende allelet. Fluorescens dataene innhentet for hver dråpe kan visualiseres i et spredningsdiagram som representerer fluorescens slippes ut av WT og MUT sonder i ulike dimensjoner. En skjematisk fremstilling av en typisk resultat for en konvensjonell ddPCR analysen er presentert i figur 1A. I dette eksemplet tilsvarer blå skyen dråpestørrelse inneholder WT alleler identifisert av WT proben, mens røde skyen tilsvarer dråper der MUT allelet har blitt forsterket og identifisert av MUT sonden. Avhengig av antall DNA i reaksjonen, kan dobbel positiv dråpestørrelse inneholder både WT og MUT amplicons vises (grønn Sky). Lys grå skyen tilsvarer tom dråper.
Siden de fleste plattformer tillater påvisning av et begrenset antall fluorophores (vanligvis 2, bortsett fra til 5), er gjennomstrømningen av konvensjonelle ddPCR begrenset. Derfor krever målretting med flere tilstøtende mutasjoner utformingen av teknisk utfordrende multiplex ddPCR analyser eller bruk av flere reaksjoner målretting hver mutasjon parallelt. Drop-off ddPCR strategi, seirer denne begrensningen som det kan potensielt oppdage eventuelle genetiske endringer innenfor et mål område med en unik WT hydrolyse sonder. Første sonde (sonde 1) dekker en ikke-variabel sekvens, målregion og andre sonden (sonde 2) er utfyllende til WT sekvensen av målregion der mutasjoner er forventet (figur 1B). Mens den første romsonden kvantifiserer totalbeløpet for amplifiable molekyler i reaksjonen, diskriminerer andre proben WT og MUT alleler av sub-optimale hybridisering i mutant sekvenser. Sonden 2 kan identifisere flere typer mutasjoner i målet regionen (ett eller flere nukleotid erstatninger, sletting, etc.)6. Som vanlig ddPCR tilsvarer lys grå skyen dråpestørrelse inneholder ingen DNA molekyler. Det er viktig å huske at i denne analysen, optimal separasjon av WT og MUT skyer er avhengig av antallet DNA lastet i reaksjonen, siden dråpestørrelse inneholder både WT og MUT målet alleler ikke kan skilles fra dråpestørrelse inneholder bare WT skjemaet. Derfor krever denne analysen at de fleste dråpestørrelse inneholder mer enn én kopi av målrettet genet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K2EDTA tube (color code : lavender)</td>
			<td>BD</td>
			<td>367863</td>
			<td>EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>For isolation of free-circulating DNA from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>937556</td>
			<td>For isolation of free-circulating DNA from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAsymphony SP system</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001297</td>
			<td>fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td>For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX100 or QX200 reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3003 or186-4003, respectively</td>
			<td>The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX100 or QX200 droplet generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3002 or 186-4002, respectively</td>
			<td>Instrument used for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td>Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>181-4000</td>
			<td>PX1&#8482; PCR plate sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge holder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3051</td>
			<td>Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartridges and gaskets</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-4007</td>
			<td>Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3010</td>
			<td>ddPCR supermix for probes (no dUTP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020362</td>
			<td>96-well semi-skirted plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>181-4040</td>
			<td>Pierceable foil heat seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3004</td>
			<td>oil used in the read</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>186-3005</td>
			<td>oil for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.051</td>
			<td>Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex I cfDNA Reference Standard Set</td>
			<td>HORIZON</td>
			<td>HD780</td>
			<td>The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&#181;L to 100 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Qubit assay tubes are 500 &#181;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single droplet digital polymerase chain reaction for comprehensive and simultaneous detection of mutations in hotspot regions

Slippverktøy digital polymerasekjedereaksjons (ddPCR) er en høylig følsom kvantitative polymerase kjedereaksjon (PCR) metode basert på prøve fraksjoneres til tusenvis av nano-størrelse vann-i-olje personlige reaksjoner. Nylig har ddPCR blitt en av de mest nøyaktige og følsom verktøyene for sirkulerende svulst DNA (ctDNA) oppdagelsen. En av de store begrensningene av standard ddPCR teknikken er begrenset antall mutasjoner som kan bli vist per reaksjon, som bestemt hydrolyse sonder anerkjenne hver mulig allel versjon kreves. En alternativ metode, drop-off-ddPCR øker gjennomstrømning, siden det krever bare et enkelt par sonder for å oppdage og kvantifisere potensielt alle genetiske endringer i regionen målrettet. Drop-off ddPCR viser sammenlignbare følsomhet til konvensjonelle ddPCR analyser med fordelen av å oppdage flere mutasjoner i en enkelt reaksjon. Det er kostnadseffektivt, sparer dyrebare utvalget materialet og kan også brukes som et funn verktøy når mutasjoner ikke er kjent en priori.

I en proof-of-concept studie, ble KRAS ekson 2 mutasjoner (kodon 12 og 13) og EGFR ekson 19 slettinger undersøkt i FFPE vev og plasmaprøver fra pasienter bruker drop-off ddPCR strategi6.
KRAS drop-off sonden avhørt en 16 bp regionen omfatter flere mutasjoner i ekson 2 av KRAS genet, som havn mer enn 95% av kjente KRAS mutasjoner i kreft hos mennesker<sup cla...

Watch this Scientific Journal Video about Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions at JoVE.com

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Her presenterer vi en protokoll for å nøyaktig kvantifisere flere genetiske endringer av målet regionen i en enkelt reaksjon drop-off ddPCR og en unik par hydrolyse sonder.

Eneste dråpe digitale polymerasekjedereaksjons omfattende og samtidige deteksjon av mutasjoner i Hotspot regioner

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Denne metoden kan brukes som et diagnostisk verktøy for kreft for å analysere sirkulerende tumor DNA. Denne teknikken forhører flere genetiske endringer i regioner av klyngemutasjoner i en enkelt reaksjon. Dette bidrar til å lagre dyrebare pasientprøver.Denne metoden kan gi innsikt i tumorbyrde på mutasjonsprofilen. Det kan nå også brukes på en molekylær analyse som et alternativ til qPCR for å oppnå en absolutt kvantifisering av nukleinsyre målsekvenser. Samle blodprøver i syv-milliliter EDTA rør.To rør anbefales å samle rundt fire milliliter plasma. Sentrifuger blodprøvene i 10 minutter ved 820 ganger tyngdekraften innen tre timer etter blodprøven for å skille røde blodlegemer, hvite blodlegemer og plasma. Tiden mellom prøvetakingen og sentrifugeringen er avgjørende for å oppnå høyverdig, T-cellefritt DNA som ikke er forurenset med DNA utgitt fra hvite blodlegemer.Etter sentrifugering, bruk en serologisk pipette for å samle supernatanten uten å berøre det hvite blodlegemerlaget. Rundt to milliliter plasma er vanligvis gjenopprettet per EDTA rør. Etter å ha overført plasmene til to milliliter rør, sentrifuger aliquots på 16,000 ganger tyngdekraften i 10 minutter ved 15 grader Celsius for å fjerne celleavfall.Samle forsiktig plasmaet uten å forstyrre pelleten og overfør til to milliliter kryogene rør. Oppbevares ved negative 80 grader Celsius til det trengs. Begynn med å legge til 400 mikroliter proteinase K til et 50-milliliter rør.Deretter legger du til fire milliliter plasma og 3,2 milliliter ACL lysisbuffer som inneholder ett mikrogram bærer RNA fra ekstraksjonssettet. Lukk røret og bland ved å virvle i 30 sekunder for å oppnå en homogen løsning. Deretter inkuber ved 60 grader Celsius i 30 minutter.Etter inkubasjonen, tilsett 7,2 milliliter buffer ACB til lysatet for å optimalisere bindingen av de sirkulerende nukleinsyrene til silikamembranen. Bland ved vortexing i 15 til 30 sekunder. Deretter inkubere røret på is i fem minutter.Fest søylen og 20 milliliters forlengeren på vakuumpumpen. Lukk ubrukte deler for å tillate vakuumaspirasjon. Etter kort sentrifugering av røret, og sett forsiktig blandingen inn i rørforlengeren.Slå deretter på vakuumpumpen og la lysatet trekkes helt gjennom kolonnene. Fjern og kast rørforlengeren. Deretter bruker du 600 mikroliter buffer ACW1 i kolonnen.Når buffer ACW1 har trukket gjennom kolonnen, legger du til 750 mikroliter ACW2-buffer, og til slutt 750 mikroliter på 96 til 100 % etanol. Deretter plasserer du kolonnen i et rent to milliliter oppsamlingsrør og sentrifuge i full hastighet i tre minutter for å eliminere etanol. Etter å ha plassert kolonnen i et nytt to milliliter oppsamlingsrør, åpne lokket og inkuber deretter ved 56 grader Celsius i 10 minutter for å tørke membranen helt.Etter inkubasjonen plasserer du kolonnen i et rent 1,5 milliliter lavtbindende rør. Påfør forsiktig 36 mikroliter RNasefritt vann med 0,04 % natriumazid. Lukk deretter lokket og inkuber ved romtemperatur i tre minutter.Sentrifuge i full fart igjen i ett minutt for å elute nukleinsyrer. Deretter oppbevares ved negative 20 grader Celsius til det trengs. Begynn med å tine og likevekte reaksjonskomponentene til romtemperatur i en ren PCR-hette.Deretter forbereder du en 20 ganger blanding av primere og sonder i RNase og Dnase-fritt destillert vann med hver primer ved 18 mikromoskonsentrasjon og hver sonde ved fem mikromoskonsentrasjon. For alle individuelle PCR-reaksjoner, lag en prøveblanding ved å kombinere 10 mikroliter av to ganger ddPCR Supermix, en mikroliter på 20 ganger primere og sonder blanding, og opptil 10 nanogram av DNA-prøven i 20 mikroliter destillert vann. Vortex reaksjonsblandingen grundig for å sikre homogenitet.Og kort sentrifuge å samle innhold på bunnen av røret før dispensering. Sett ddPCR-sylinderampullen inn i holderen og legg 20 mikroliter prøvereaksjonsblanding inn i de midterste brønnene i sylinderampullen for dråpegenerering. Tilsett 70 mikroliter dråpegeneratorolje i de nederste brønnene.Sett sylinderampullen med en pakning inn i dråpegeneratoren. Dråper vil bli produsert i de øverste brønnene av patronen. Aspirer sakte og forsiktig 40 mikroliter av dråpene fra patronene og dispenser inn i en 96-brønns PCR-plate.Forsegle den endelige PCR-platen med aluminiumsfolie ved hjelp av en platetetning umiddelbart etter overføring av dråper for å unngå fordampning. Sentrifuger platen kort for å samle inn innhold på bunnen av brønnene. Kjør en konvensjonell PCR-forsterkning på en termisk cycler.Når løpet er fullført, sentrifuger platen kort for å samle inn innhold på bunnen av brønnene. Etter PCR-forsterkning bruker du dråpeleseren til å telle PCR-positive og PCR-negative dråper etter produsentens instruksjoner. Følgende er representative resultater oppnådd under optimaliseringstrinnene for levering av ddPCR-analysen.Dette bildet viser påvisning av mutert DNA og vilt-type DNA i en reaksjon som inneholder 100% mutert DNA, 5% mutant DNA, og 100% vill-type DNA. Dette bildet viser eksempler på plasmaprøver analysert med KRAS- og EGFR-leverings-ddPCR-analysene som viser påvisning av enkeltkjerner og flere erstatninger i exon to av KRAS og en sletting i EGFR exon 19. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å fortsette forsiktig på hvert trinn med spesiell oppmerksomhet på dråpegenereringen, som er et kritisk trinn i denne metoden.Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forsker og kliniker innen kreftforskning for å optimalisere tumormutasjonsanalyse ved hjelp av flytende biopsi.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

DNA, Cells, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Forbedret Polymerase Chain Reaction-rflp Genotyping av Toxic Pufferfish ved væskekromatografi / massespektrometri

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

Visual Colorimetric Påvisning av Multi-nukleotid polymorfismer på en pneumatisk Droplet Manipulasjon Platform

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Villtype Blokkering PCR Kombinert med direkte sekvensering som en svært følsom metode for påvisning av lavfrekvent somatiske mutasjoner

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral skanning: Mapping MLV Integrering Sites for å definere Cell-spesifikke Regulatory Regioner

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi kvantitative påvisning av RNA-avhengig RNA Polymerase aktivitet av menneskelig Telomerase revers transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-mediert reorganisering av Chromatin Loop struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differensiering, vedlikehold og analyse av menneskelig netthinnens Pigment epitel celler: en sykdom-i-en-fat modell for BEST1 mutasjoner

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikasjon av homologe rekombinasjon hendelser i mus embryonale stamceller Southern Blotting og polymerasekjedereaksjons

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluering av en Universal nestet omvendt transkripsjon polymerase Kjedere reaksjon for påvisning av Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...