Name: nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart
Uploaded: 2018-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

作者感谢 IC 布鲁斯博士的批评性评论和阅读手稿。这项工作得到了中国国家自然科学基金 (31430059、31701272、31730061、81470399和 31521062)、亚洲经济和新兴市场创新医学和早期发展的资助。

所有动物程序都使用了由北京大学机构动物护理和使用委员会批准的斑马鱼议定书, 该协议由实验室动物护理评估和认可协会完全认可。
1. Tricaine 溶液的制备
<ol><li>要准备 tricaine 的溶液, 添加400毫克 3-氨基苯甲酸甲基磺酸粉到97.9 毫升蒸馏水, 然后加入2.1 毫升的1米 (ph 9.5) 调整 ph 值 ~ 7。将库存解决方案存储在摄氏4摄氏度。</li>
	<li>为准备 tricaine 工作解决方案, 添加4.2 毫升 tr...

斑马鱼完全有能力再生各种器官, 包括成人心脏5。尽管转基因和遗传方法在研究斑马鱼胚胎中的基因功能方面发展良好, 研究者仍面临着在斑马鱼45,46中产生条件突变基因的艰巨任务。因此, 转基因显性阴性突变体或小分子抑制剂经常被用来处理成年斑马鱼器官的基因功能25,27,<sup class...

心肌梗死已成为严重的健康威胁, 导致1世界各地的巨大经济负担。成年哺乳动物心脏在损伤后无法再生和补充失去的心肌细胞, 导致瘢痕组织的形成和随后的心力衰竭。与哺乳动物不同的是, 斑马鱼能够心脏再生, 主要是通过各种类型的心脏损伤后的强健心肌增生, 使其成为研究心脏再生分子机制的理想模型有机体。2,3,4,5,6,7,8。破译斑马鱼心脏再生的内源机制是一个令人兴奋的研究领域, 寻找新的治疗策略, 以改善人类心脏再生9。
在斑马鱼身上有遗传操作方法。这些包括 morpholinos (MO), 也广泛用于青蛙, 小鸡和哺乳动物除斑马鱼10,11,12,13。MO 在成年斑马鱼鳍, 脑, 视网膜14,15,16,17,18,19, 有效地击倒靶基因表达。锁定核酸 (低噪声放大器) 是另一种用于除斑马鱼胚胎中的内源基因表达的人工寡核苷酸, 在成年动物器官中也有20,21,22,23,24. 然而, 对于成年人心脏缺乏有效的功能丧失方法, 仍然是研究器官再生分子机制的一个障碍。目前, 小分子抑制剂或显性阴性突变体的转基因表达主要用于阻断某一基因或通路的功能, 以研究其在斑马鱼心脏再生25、26 中的作用. ,27。然而, 并非所有的基因或信号通路都适用于这些方法。
小干扰 rna (siRNAs) 广泛应用于哺乳动物细胞和模型生物体胚胎的功能损失分析, 以及动物模型28、29、30的临床前研究的成人器官。,31,32. siRNAs 已有效地用于沉默的肿瘤33,34,35和心肌细胞36,37,38,39 的基因 ,40 通过不同的交付系统。最近, 我们开发了有效的 siRNA 封装纳米颗粒基因沉默的再生成人心脏使用几种不同的纳米粒子41,42,43, 提供了一个新的工具成年斑马鱼器官基因的功能研究。根据我们以前的研究41,42,43, 这里我们提出了一个简单的, 实用的, 但强大的协议 siRNA 基因沉默在再生成年斑马鱼心脏使用 f-PAMAM-PEG-R9大分子.Aldh1a2(醛脱氢酶1家族, 成员 A2) 基因上调后, 斑马鱼的先端切除和消融Aldh1a2阻断心脏再生44。以aldh1a2基因为例, 对纳米粒子包覆 siRNA 注射液介导的基因击倒效率进行了测试。本协议包含了斑马鱼心脏切除、纳米微粒的化学合成和 siRNA 包裹纳米微粒向成年斑马鱼心脏的传递方法。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:765px;" width="765">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">tricaine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:193px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:180px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:193px;">S8AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sharp forcep</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">14098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">iridectomy scissors</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">elbow tweezers</td>
			<td style="width:180px;">Suzhou Liuliu</td>
			<td style="width:193px;">SE05Cr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">&#945;,&#969;-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py)</td>
			<td style="width:180px;">Biomatrik (Jiaxing) Inc.</td>
			<td style="width:193px;">5239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM)</td>
			<td style="width:180px;">Andrews ChemServices</td>
			<td style="width:193px;">AuCS-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">vacuum drying equipment</td>
			<td style="width:180px;">Yiheng</td>
			<td style="width:193px;">DZF-6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:193px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)</td>
			<td style="width:180px;">Alfar Aesar</td>
			<td style="width:193px;">51805-45-9</td>
			<td>Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Millipore</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">freeze dryer</td>
			<td style="width:180px;">Martin Christ</td>
			<td style="width:193px;">Alpha 2-4 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:193px;">AV400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:225px;">Deuterium oxide(D2O)</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td style="width:193px;">174611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR sample tube</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td>WG-1000-7-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 kDa MWCO ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sea salts</td>
			<td style="width:180px;">Instant Ocean&#174;</td>
			<td style="width:193px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart

哺乳动物在心肌梗死后再生心脏的能力非常有限。另一方面, 成年斑马鱼在先端切除或 cryoinjury 后再生心脏, 使其成为心脏再生研究的重要模型机体。然而, 缺乏功能丧失的成人器官的方法, 限制了对心脏再生机制的洞察力。RNA 干扰通过不同的运载系统是一个强有力的工具为沉默基因在哺乳动物细胞和模型有机体。我们以前曾报道, siRNA 纳米粒子成功地进入细胞, 并导致在再生的成年斑马鱼心脏显着基因特定的击倒。在这里, 我们提出了一个简单, 快速, 有效的协议大分子介导的 siRNA 交付和基因沉默的再生成年斑马鱼心脏。该方法为确定斑马鱼成年器官中的基因功能提供了一种替代方法, 可推广到其他模型生物中。

为了确定大分子介导的 siRNA 分娩的效率, 我们切除了斑马鱼心脏心室的顶端, 然后注射了约10µL 的大分子 (模拟组), Cy5-siRNA 只 (裸组), 或 f-PAMAM-PEG-R9 大分子封装Cy5-siRNA (Cy5-siRNA 组) intrapleurally 分别 (图 2A B)。荧光信号是可检测的心脏注射大分子封装 Cy5-siRNA 在 3, 24 和 48 hpi (小时后注射), 而它是很难检测到心脏从模拟和裸组在 48 hpi (<strong cla...

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Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

纳米粒子介导的 siRNA 基因沉默在斑马鱼心脏中的表达

在成年斑马鱼器官中发展有条件基因剔除或有效基因击倒仍是一项重大挑战。在这里, 我们报告了在成年斑马鱼心脏执行纳米粒子介导的 siRNA 基因沉默的协议, 从而为研究斑马鱼和其他模型生物体中的成年器官提供了一种新的功能损失方法。

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

肾再生的成年斑马鱼庆大霉素性损伤

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

科研

发育生物学

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

大规模的斑马鱼胚胎的心脏解剖的转录分析

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

斑马鱼幼虫骨骼肌诚信与伊文思蓝分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

分离培养成年斑马鱼脑源性神经球

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

分离和斑马鱼胚胎单细胞的表征

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

生物传感运动神经元膜电位在活斑马鱼胚胎

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

成年转基因斑马鱼视网膜外植体培养由多光子显微镜活细胞成像

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

成人果蝇脑内蘑菇体和感光神经元的解剖和荧光染色

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

人成体和胎心标本中原发性心外膜细胞的分离培养

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

成人耳皮肤全安装共焦显微术: 一种研究神经血管分支形态发生和免疫细胞分布的模型系统

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...