Name: nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart
Uploaded: 2018-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Forfatterne takke Dr. IC Bruce for kritiske kommentarer og læsning af manuskript. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 og 31521062), AstraZeneca Asien og Emerging Market innovativ medicin og tidlige udvikling.

Alle dyr procedurer bruges en zebrafisk protokol godkendes af det institutionelle Animal Care og brug udvalg ved Peking University, som er fuldt ud godkendt af Association for evaluering og akkreditering af Laboratory Animal Care.
1. forberedelse af Tricaine løsning
<ol><li>For at forberede tricaine stamopløsning, tilføje 400 mg ethyl 3-aminobenzoat methanesulfonate pulver til 97,9 mL destilleret vand og derefter tilsættes 2,1 mL 1 M Tris (pH 9.5) til at justere pH ~ 7. Butik stamopløsn...

For zebrafisk er fuldt ud i stand til at regenerere en række organer, herunder voksen hjerte5. Mens transgene og genetiske metoder er veludviklet for at studere genet funktioner i embryoner fra zebrafisk, efterforskere stadig over for en skræmmende opgave at generere betinget mutante alleler i zebrafisk45,46. Således transgene dominerende-negative mutanter eller små-molekyle hæmmere bruges ofte til adresse genet funktioner i voksen ze...

Myokardieinfarkt er blevet en stor sundhedstrussel, fører til en enorm økonomisk byrde omkring verden1. Den voksne pattedyr hjerte undlader at regenerere og genopbygge den tabte cardiomyocytes på en makroskopisk skala efter den skade, hvilket fører til dannelsen af ar væv og efterfølgende hjertesvigt. I modsætning til pattedyr er zebrafisk i stand til at hjertet regenerering, primært gennem robust Myokardie spredning efter forskellige typer af hjerte skade, hvilket gør det en ideel model organisme for at undersøge de molekylære mekanismer af hjertet regenerering 2,3,4,5,6,7,8. Decifrere de endogene mekanismer er underliggende zebrafisk hjerte regenerering et spændende område for forskning i søgningen for nye terapeutiske strategier til at forbedre menneskers hjerte regenerering9.
Genetisk manipulation metoder er tilgængelige i zebrafisk. Disse består af morpholinos (MO), er også meget udbredt i frøer, kylling og pattedyr udover i zebrafisk10,11,12,13. MO har effektive knockdown af target genekspression i voksen zebrafisk fin, hjernen og nethinden14,15,16,17,18,19. Låst-nucleic acid (LNA) er en anden kunstig oligonukleotid bruges til at banke ned endogene genekspression i zebrafisk embryoner, men også i voksne dyrs organer20,21,22,, 23 , 24. dog manglen på effektive tab af funktion metoder for voksnes hjerter stadig en hindring i at studere de molekylære mekanismer af orgel regeneration. På nuværende, små-molekyle hæmmere eller transgene udtryk for dominerende-negative mutanter bruges primært til at blokere funktionen af et bestemt gen eller vej at undersøge dets funktion i voksen zebrafisk hjerte regenerering25,26 ,27. Dog ikke alle gener eller signaling veje er gældende for disse metoder.
Blander sig små RNA'er (siRNAs) er almindeligt anvendt til analysen af tab af funktion i pattedyrsceller og embryoner af modelorganismer samt voksne organer efter prækliniske undersøgelser i dyr modeller28,29,30 , 31 , 32. siRNAs har brugt effektivt til tavshed gener i tumorer33,34,35 og cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 via forskellige leveringssystemer. For nylig har udviklet vi effektive siRNA-indkapslede nanopartikel genhæmning i regenererende voksen hjertet ved hjælp af flere forskellige nanopartikler41,42,43, giver et nyt værktøj til funktionelle studier af gener i voksen zebrafisk organer. Baseret på vores tidligere undersøgelser41,42,43, her vil vi præsentere en enkel, praktisk, men kraftfuld protokol for siRNA genhæmning i regenererende voksen zebrafisk hjertet ved hjælp af f-PAMAM-PIND-R9 dendrimers. Aldh1a2 (aldehyd dehydrogenase 1, familiemedlem A2) gen var upregulated efter zebrafisk apex resektion og ablation af Aldh1a2 blokeret hjerte regenerering44. Her tager vi aldh1a2 genet som et eksempel at teste gen knockdown effektivitet medieret af nanopartikler-indkapslede siRNA injektion. Denne protokol indeholder en procedure for zebrafisk hjerte resektion, kemisk syntese af nanopartikler og en leveringsmetode på siRNA-indkapslede nanopartikler i voksen zebrafisk hjerte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:765px;" width="765">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">tricaine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:193px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:180px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:193px;">S8AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sharp forcep</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">14098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">iridectomy scissors</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">elbow tweezers</td>
			<td style="width:180px;">Suzhou Liuliu</td>
			<td style="width:193px;">SE05Cr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">&#945;,&#969;-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py)</td>
			<td style="width:180px;">Biomatrik (Jiaxing) Inc.</td>
			<td style="width:193px;">5239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM)</td>
			<td style="width:180px;">Andrews ChemServices</td>
			<td style="width:193px;">AuCS-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">vacuum drying equipment</td>
			<td style="width:180px;">Yiheng</td>
			<td style="width:193px;">DZF-6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:193px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)</td>
			<td style="width:180px;">Alfar Aesar</td>
			<td style="width:193px;">51805-45-9</td>
			<td>Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Millipore</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">freeze dryer</td>
			<td style="width:180px;">Martin Christ</td>
			<td style="width:193px;">Alpha 2-4 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:193px;">AV400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:225px;">Deuterium oxide(D2O)</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td style="width:193px;">174611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR sample tube</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td>WG-1000-7-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 kDa MWCO ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sea salts</td>
			<td style="width:180px;">Instant Ocean&#174;</td>
			<td style="width:193px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart

Pattedyr har en meget begrænset kapacitet til at regenerere hjertet efter myokardieinfarkt. På den anden side regenererer den voksne zebrafisk sit hjerte efter apex resektion eller cryoinjury, hvilket gør det en vigtig model organisme for hjertet regenerering undersøgelse. Manglen på tab af funktion metoder for voksne organer har imidlertid begrænset indsigt i de underliggende hjerte regenerering mekanismer. RNA-interferens via forskellige leveringssystemer er et kraftfuldt værktøj til silencing gener i pattedyrsceller og modelorganismer. Vi har tidligere rapporteret at siRNA-indkapslede nanopartikler med held angive celler og resultere i en bemærkelsesværdig gen-specifikke knockdown i regenererende voksen zebrafisk hjertet. Her præsenterer vi en enkel, hurtig og effektiv protokol for dendrimer-medieret siRNA levering og genhæmning regenererende voksen zebrafisk midt. Denne metode giver en alternativ metode til bestemmelse af genet funktioner i voksen organer i zebrafisk og kan udvides til at omfatte andre modelorganismer så godt.

For at bestemme effektiviteten af dendrimer-medieret siRNA levering, vi resektion apex af ventrikel zebrafisk hjerte, derefter injiceres 10 µL af dendrimer kun (mock gruppe), Cy5-siRNA kun (nøgen gruppe) eller f-PAMAM-PIND-R9 dendrimer-indkapslede Cy5-siRNA (Cy5-siRNA gruppe) intrapleurally, henholdsvis (figur 2A-B). Fluorescens signal var påvises i hjerter sprøjtes med dendrimer-indkapslede Cy5-siRNA på 3, 24 og 48 hpi (timer efter inje...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Nanopartikler-medieret siRNA genhæmning i voksen zebrafisk hjerte

Det er fortsat en stor udfordring at udvikle betinget af gen-knockout eller effektiv af gen-knockdown i voksen zebrafisk organer. Her rapporterer vi en protokol for udfører nanopartikel-medieret siRNA genhæmning i voksen zebrafisk hjertet, hvilket giver en ny tab af funktion metode til at studere voksen organer i zebrafisk og andre modelorganismer.

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nyre Regeneration i Adult Zebrafisk af Gentamicin induceret skade

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Storstilet zebrafisk Embryonale Heart Dissektion for Transkriptionel Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolering og dyrkning af Adult Zebrafisk Brain-afledte Neurosfærer

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering af enkeltceller fra zebrafisk embryoer

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membran Potential i Live Zebrafish Embryoer

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Culture of Adult transgene zebrafisk Retinal Eksplantater til Live-celle Imaging af multifoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Isolation og kultur af primær epikardielle celler, der stammer fra menneskelige voksen og fostrets hjerte prøver

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...