Name: nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart
Uploaded: 2018-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

De auteurs bedanken Dr. IC Bruce voor kritische opmerkingen en het lezen van het manuscript. Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale Natural Science Foundation van China (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 en 31521062), de AstraZeneca Azië, en de opkomende markt innovatieve geneeskunde en de vroege ontwikkeling.

Alle dierlijke procedures gebruikt een protocol van de zebravis goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Universiteit van Peking, die is volledig geaccrediteerd door de vereniging voor de beoordeling en de accreditatie van Laboratory Animal Care.
1. bereiding van tricaïne oplossing
<ol><li>Ter voorbereiding van de stockoplossing tricaïne, 400 mg ethyl 3-aminobenzoaat methanesulfonate poeder toevoegen aan 97.9 mL gedestilleerd water en voeg toe 2,1 mL 1 M Tr...

De zebravis is volledig geschikt voor het regenereren van allerlei organen, inclusief de volwassen hart5. Terwijl transgene en genetische methoden goed ontwikkelde zijn voor het bestuderen van functies van het gen in de embryo's van zebravis, worden onderzoekers nog steeds geconfronteerd met de lastige taak van het genereren van voorwaardelijke mutant allelen in zebrafish45,46. Dus, transgene dominant-negatieve mutanten of kleine-molecuul ...

Myocardinfarct is uitgegroeid tot een grote gezondheidsbedreiging, wat leidt tot een enorme economische last rond de wereld1. De volwassen zoogdieren hart niet regenereren en vullen de verloren cardiomyocytes op macroscopische schaal na de verwonding, wat leidt tot de vorming van het litteken weefsels en latere hartfalen. In tegenstelling tot zoogdieren is de zebravis hart regeneratie, voornamelijk door de robuuste myocardiale proliferatie na verschillende soorten hart schade, waardoor het een ideale modelorganisme voor het onderzoek naar de moleculaire mechanismen van hart regeneratie mogelijk 2,3,4,5,6,7,8. Ontcijferen van de endogene mechanismen is onderliggende zebrafish hart regeneratie een spannende gebied van onderzoek in de zoektocht naar nieuwe therapeutische strategieën ter verbetering van menselijk hart regeneratie9.
Genetische manipulatie methoden zijn beschikbaar in zebrafish. Deze bestaan uit morpholinos (MO), die ook op grote schaal worden gebruikt in kikkers, kuiken, en zoogdieren naast in zebrafish10,11,12,13. MO heeft efficiënte knockdown van doel genexpressie in de volwassen zebrafish fin, de hersenen en het netvlies14,15,16,17,18,19. Vergrendeld-nucleic zuur (LNA) is een andere kunstmatige oligonucleotide gebruikt voor het neerhalen van endogene genexpressie niet alleen in zebrafish embryo's, maar ook in volwassen dierlijke organen20,21,22, 23 , 24. het ontbreken van effectieve methoden van de verlies-van-functie voor volwassenen hart blijft echter een obstakel bij het bestuderen van de moleculaire mechanismen van orgel regeneratie. Bij de huidige, kleine-molecuul remmers of transgene expressie van dominant-negatieve mutanten worden voornamelijk gebruikt voor het blokkeren van de functie van een bepaald gen of traject te bestuderen zijn functie in de volwassen zebrafish hart regeneratie25,26 ,27. Echter niet alle genen of signaalroutes gelden voor deze methoden.
Kleine-inmenging RNAs (siRNAs) worden veel gebruikt voor de analyse van de verlies-of-function in zoogdiercellen en embryo's van modelorganismen, evenals volwassen organen voor preklinische studies in dierlijke modellen28,29,30 , 31 , 32. siRNAs zijn effectief gebruikt om genen in tumoren33,34,35 en in cardiomyocytes36,37,38,39 zwijgen ,40 via verschillende levering systemen. Onlangs, ontwikkelden we efficiënte siRNA ingekapseld nanoparticle gen-zwijgen in de verkwikkende volwassen hart met behulp van verscheidene verschillende nanodeeltjes41,42,43, die een nieuwe tool voor bieden: functionele studies van genen in volwassen zebrafish organen. Gebaseerd op onze eerdere studies41,42,43, presenteren hier wij een eenvoudige, praktische, maar krachtige protocol voor siRNA gen-zwijgen in de verkwikkende volwassen zebrafish hart met behulp van de f-PAMAM-PEG-R9 dendrimeren. Aldh1a2 (aldehyde dehydrogenase 1, familielid A2) gene was upregulated na zebrafish apex resectie en ablatie van Aldh1a2 geblokkeerd de cardiale regeneratie44. Hier nemen we aldh1a2 gen als een voorbeeld voor het testen van de gene vechtpartij efficiëntie gemedieerd door nanoparticle-ingekapseld siRNA injectie. Dit protocol bevat een procedure voor de zebravis hart resectie, chemische synthese van nanodeeltjes en een leveringsmethode op siRNA ingekapseld nanodeeltjes in volwassen zebrafish hart.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:765px;" width="765">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">tricaine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:193px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:180px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:193px;">S8AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sharp forcep</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">14098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">iridectomy scissors</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">elbow tweezers</td>
			<td style="width:180px;">Suzhou Liuliu</td>
			<td style="width:193px;">SE05Cr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">&#945;,&#969;-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py)</td>
			<td style="width:180px;">Biomatrik (Jiaxing) Inc.</td>
			<td style="width:193px;">5239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM)</td>
			<td style="width:180px;">Andrews ChemServices</td>
			<td style="width:193px;">AuCS-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">vacuum drying equipment</td>
			<td style="width:180px;">Yiheng</td>
			<td style="width:193px;">DZF-6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:193px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)</td>
			<td style="width:180px;">Alfar Aesar</td>
			<td style="width:193px;">51805-45-9</td>
			<td>Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Millipore</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">freeze dryer</td>
			<td style="width:180px;">Martin Christ</td>
			<td style="width:193px;">Alpha 2-4 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:193px;">AV400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:225px;">Deuterium oxide(D2O)</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td style="width:193px;">174611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR sample tube</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td>WG-1000-7-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 kDa MWCO ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sea salts</td>
			<td style="width:180px;">Instant Ocean&#174;</td>
			<td style="width:193px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart

Zoogdieren hebben een zeer beperkte capaciteit om te regenereren het hart na een myocardinfarct. Aan de andere kant, regenereert de volwassen zebrafish het hart na apex resectie of cryoinjury, waardoor het een belangrijk model-organisme voor hart regeneratie studie. Echter heeft het gebrek aan verlies-van-functie methoden voor volwassen organen beperkt inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de regeneratie van het hart. RNA-interferentie via verschillende afgiftesystemen is een krachtig hulpmiddel voor silencing genen in zoogdiercellen en modelorganismen. Eerder hebben we gemeld dat siRNA ingekapseld nanodeeltjes succesvol invoeren van cellen en leiden een opmerkelijke gen-specifieke knockdown regeneratie volwassen zebrafish middenin tot. Hier presenteren we een eenvoudige, snelle en efficiënte protocol voor de levering van Dendrimeer-gemedieerde siRNA en gen-zwijgen in de verkwikkende volwassen zebrafish hart. Deze methode biedt een alternatieve benadering voor het bepalen van de functies van het gen in volwassen organen in zebrafish en kan worden uitgebreid tot andere modelorganismen als goed.

Om te bepalen van de efficiëntie van de levering van Dendrimeer-gemedieerde siRNA, we gereseceerd de apex van de ventrikel van de zebravis hart, dan ongeveer 10 µL van Dendrimeer alleen (mock groep), Cy5-siRNA alleen (naakte groep) of f-PAMAM-PEG-R9 Dendrimeer-ingekapseld geïnjecteerd Cy5-siRNA (Cy5-siRNA groep) intrapleurally, respectievelijk (Figuur 2A-B). De fluorescentie-signaal was aantoonbaar in het hart ingespoten met Dendrimeer-ing...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Nanoparticle-gemedieerde siRNA Gene-zwijgen in volwassen Zebrafish hart

Het blijft een grote uitdaging om voorwaardelijke gen-knock-out of effectief gen-knockdown in volwassen zebrafish organen. Wij rapporteren hier een protocol voor presterende nanoparticle-gemedieerde siRNA gen-zwijgen in volwassen zebrafish hart, waardoor een nieuwe methode van het verlies-van-functie voor het bestuderen van volwassen organen in zebrafish en andere modelorganismen.

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nier Regeneratie in Adult zebravis door Gentamicin geïnduceerd letsel

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Grootschalige de zebravis embryonale Hart Dissection voor Transcriptionele Analyse

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolatie en cultuur van de Adult zebravis Brain-afgeleide Neurosferen

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membraan Potentieel in Live Zebrafish Embryo&#39;s

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Cultuur van volwassen transgene zebravis Retina Explantaten voor Live-cell imaging van Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

De isolatie en de cultuur van de primaire Epicardial cellen, afgeleid van menselijke volwassen en foetale hart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie