Name: nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart
Uploaded: 2018-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Les auteurs remercient Dr IC Bruce d’observations critiques et la lecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 et 31521062), en Asie de AstraZeneca et émergents marché médecine innovatrice et développement précoce.

Toutes les procédures animales utilisé un protocole de poisson-zèbre approuvé par le Comité de l’urbanisme à l’Université de Pékin, qui est entièrement accrédité par Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care et d’institutionnels animalier.
1. préparation de la Solution de tricaïne
<ol><li>Pour préparer la solution mère de tricaïne, ajouter 400 mg éthyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate de poudre à 97,9 mL d’eau distillée et ajouter ensu...

Le poisson-zèbre est tout à fait capable de régénérer des divers organes dont le coeur adulte5. Tandis que les méthodes transgéniques et génétiques sont bien développés pour l’étude des fonctions des gènes chez les embryons de poisson-zèbre, enquêteurs sont toujours confrontés à la lourde tâche de générer des allèles mutants conditionnels dans le poisson-zèbre45,46. Ainsi, des mutants transgéniques dominant négati...

L’infarctus du myocarde est devenu une menace de santé majeur, conduisant à un énorme fardeau économique autour du monde1. Le cœur des mammifères adult ne parvient pas à se régénérer et reconstituer les cardiomyocytes perdues sur une échelle macroscopique après la blessure, conduisant à la formation de tissus cicatriciels et une insuffisance cardiaque subséquente. Contrairement aux mammifères, le poisson-zèbre est capable de régénération de coeur, principalement par le biais de la prolifération du myocarde robuste après les différents types de lésion cardiaque, ce qui en fait un organisme modèle idéal pour étudier les mécanismes moléculaires de régénération de coeur 2,3,4,5,6,7,8. Décrypter les mécanismes endogènes sous-jacent régénération de coeur de poisson-zèbre est un domaine passionnant de recherche dans la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques améliorer la régénération de coeur humain9.
Il existe des méthodes de manipulation génétique chez le poisson zèbre. Il s’agit de morpholinos (MO) qui sont également largement utilisés dans les grenouilles, Poussin et les mammifères en plus dans le poisson-zèbre10,11,12,13. MO a précipitation efficace d’expression des gènes cible dans la nageoire de poisson-zèbre adulte, le cerveau et la rétine14,15,16,17,18,19. L’acide nucléique verrouillé (LNA) est un autre oligonucléotide artificielle utilisée pour abattre l’expression des gènes endogènes non seulement dans des embryons de poisson-zèbre, mais aussi dans des organes animaux adultes20,21,22, 23 , 24. Cependant, l’absence de méthodes efficaces de perte de fonction pour les coeurs des adultes demeure un obstacle dans l’étude des mécanismes moléculaires de la régénération de l’orgue. À présents, petites molécules inhibiteurs ou expression transgénique de mutants dominants négatifs sont principalement utilisés pour bloquer la fonction d’un gène ou une voie d’étudier sa fonction dans le poisson-zèbre adulte coeur régénération25,26 ,,27. Cependant, tous les gènes ou les voies de signalisation sont applicables pour ces méthodes.
Petit-interférant RNAs (siARN) sont largement utilisés pour l’analyse de la perte de fonction dans les cellules de mammifères et d’embryons des organismes modèles, ainsi que des organes adultes pour des études précliniques chez animal modèles28,29,30 , 31 , 32. siARN ont été utilisés efficacement pour réduire au silence des gènes dans les tumeurs33,34,35 et dans les cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 par l’intermédiaire de différents vecteurs. Récemment, nous avons développé efficace encapsulé siARN NANOPARTICULE-silençage génique en plein adulte régénérant à l’aide de plusieurs différentes nanoparticules41,42,43, fournissant un nouvel outil pour études fonctionnelles des gènes dans les organes de poisson-zèbre adulte. D’après nos précédentes études41,42,43, nous présentons un protocole simple, pratique et puissant pour les siARN gène-baffle en plein coeur de poisson-zèbre adulte régénérant à l’aide de f-PAMAM-PEG-R9 dendrimères. Aldh1a2 (aldéhyde déshydrogénase 1, membre de la famille A2) gène a augmenté après résection d’apex de poisson-zèbre et ablation des Aldh1a2 bloqué la régénération cardiaque44. Ici nous prenons aldh1a2 gène par exemple pour tester l’efficacité défiant gène médiée par injection de siARN nanoparticules encapsulées. Ce protocole prévoit une procédure pour résection de coeur de poisson-zèbre, la synthèse chimique des nanoparticules et une méthode de livraison sur les nanoparticules de siARN encapsulé dans le coeur de poisson-zèbre adulte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:765px;" width="765">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">tricaine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:193px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:180px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:193px;">S8AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sharp forcep</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">14098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">iridectomy scissors</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">elbow tweezers</td>
			<td style="width:180px;">Suzhou Liuliu</td>
			<td style="width:193px;">SE05Cr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">&#945;,&#969;-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py)</td>
			<td style="width:180px;">Biomatrik (Jiaxing) Inc.</td>
			<td style="width:193px;">5239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM)</td>
			<td style="width:180px;">Andrews ChemServices</td>
			<td style="width:193px;">AuCS-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">vacuum drying equipment</td>
			<td style="width:180px;">Yiheng</td>
			<td style="width:193px;">DZF-6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:193px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)</td>
			<td style="width:180px;">Alfar Aesar</td>
			<td style="width:193px;">51805-45-9</td>
			<td>Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Millipore</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">freeze dryer</td>
			<td style="width:180px;">Martin Christ</td>
			<td style="width:193px;">Alpha 2-4 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:193px;">AV400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:225px;">Deuterium oxide(D2O)</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td style="width:193px;">174611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR sample tube</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td>WG-1000-7-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 kDa MWCO ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sea salts</td>
			<td style="width:180px;">Instant Ocean&#174;</td>
			<td style="width:193px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart

Les mammifères ont une capacité très limitée pour régénérer le coeur après infarctus du myocarde. En revanche, le poisson-zèbre adult régénère son cœur après résection de l’apex ou cryoinjury, ce qui en fait un organisme modèle important pour l’étude de la régénération cardiaque. Toutefois, le manque de méthodes de perte de fonction d’organes adultes a limité à mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent la régénération cardiaque. L’interférence ARN via différents vecteurs est un outil puissant pour faire taire des gènes dans les cellules de mammifères et des organismes modèles. Nous avons déjà rapporté que nanoparticules siARN encapsulé avec succès entrer dans les cellules et entraînent un knockdown de gène-spécifique remarquable au coeur de poisson-zèbre adulte en régénération. Nous présentons ici un protocole simple, rapid et efficace pour la médiation dendrimère ARNsi et gène-baffle en plein coeur de poisson-zèbre adulte en régénération. Cette méthode fournit une autre méthode pour déterminer la fonction des gènes dans les organes adultes chez le poisson zèbre et peut être étendue à d’autres organismes de modèle aussi bien.

Pour déterminer l’efficacité de la médiation dendrimère ARNsi, nous réséqué l’apex du ventricule du coeur zebrafish, puis injecté environ 10 µL de dendrimer seulement (groupe fictif), Cy5-siARN seulement (groupe nu) ou f-PAMAM-PEG-R9 dendrimère-encapsulés Intrapleurale Cy5-siARN (groupe Cy5-siARN), respectivement (Figure 2A-B). Le signal de fluorescence a été détecté dans les coeurs injectés avec dendrimère-encapsulés Cy...

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Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

SiRNA de nanoparticule-mediated Gene silencing coeur de poisson-zèbre adulte

Il reste un défi majeur pour développer conditionnelle gène-knockdown gène-masquage ou efficace dans les organes de poisson-zèbre adulte. Nous rapportons ici un protocole pour exécutante siARN médiée par les nanoparticules gène-baffle en coeur de poisson-zèbre adulte, fournissant ainsi une nouvelle méthode de perte de fonction pour l’étude des organes adultes dans le poisson-zèbre et autres organismes modèles.

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Régénération rénale à l&#39;âge adulte poisson zèbre par gentamicine blessures induites

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Recherche

Biologie du développement

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

À grande échelle de poisson zèbre embryonnaire Coeur Dissection d&#39;analyse transcriptionnelle

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolement et culture de neurosphères Adult Zebrafish Brain-dérivés

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d&#39;embryons de poisson zèbre

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Potentiel de membrane de neurones moteurs dans les embryons vivants de zébrés

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

L’isolement et la Culture de cellules primaires épicardiques spécimens de coeur adultes et du foetus humain

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Entier-Montez la microscopie confocale pour la peau de l’oreille d’adulte : un système modèle pour étudier la morphogenèse ramification Neuro-vasculaire et la Distribution de cellules immunitaires

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...