Name: nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart
Uploaded: 2018-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. IC Bruce für kritische Anmerkungen und das Manuskript zu lesen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom National Natural Science Foundation of China (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 und 31521062), AstraZeneca Asien und Emerging Market Innovative Medizin und frühe Entwicklung unterstützt.

Alle tierische Verfahren verwendet ein Zebrafisch-Protokoll durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der Universität Peking, die vollständig von Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care akkreditiert ist genehmigt.
1. Vorbereitung der Tricaine Lösung
<ol><li>Um Tricaine-Stammlösung vorzubereiten, 97,9 mL destilliertem Wasser 400 mg Ethyl 3-Aminobenzoate Methanesulfonate Pulver hinzu, und fügen Sie dann 2,1 mL 1 M Tris (pH 9,5) zur Einstellu...

Der Zebrabärbling ist durchaus in der Lage verschiedenste Organe einschließlich der Erwachsenen Herzen5zu regenerieren. Während transgene und genetische Methoden gut entwickelte für die Erforschung von Genfunktionen in die Embryonen von Zebrafisch sind, stehen Ermittler noch die schwierige Aufgabe bedingte mutierten Allele im Zebrafisch45,46zu generieren. Somit sind transgene Dominant-Negative Mutanten oder Small-Molecule-Hemmer häufi...

Herzinfarkt ist eine große Gesundheitsgefahr, führt zu einer enormen wirtschaftlichen Belastung rund um die Welt1geworden. Die Erwachsenen Säugetier-Herz schlägt fehl, zu regenerieren und wieder aufzufüllen verloren Kardiomyozyten auf einer makroskopischen Skala nach der Verletzung, führt zur Bildung von Narbengewebe und anschließende Herzinsuffizienz. Im Gegensatz zu Säugetieren vermag der Zebrabärbling Herz Regeneration, in erster Linie durch die robuste myokardialen Verbreitung nach verschiedenen Arten von Herz-Verletzungen, so dass es eine ideale Modellorganismus zur Erforschung der molekularen Mechanismen der Herz Regeneration 2,3,4,5,6,7,8. Entschlüsselung der endogenen Mechanismen ist die zugrunde liegende Zebrafisch Herz Regeneration ein spannendes Gebiet der Forschung bei der Suche nach neuartigen therapeutischen Strategien zur Verbesserung der menschlichen Herzens Regeneration9.
Genmanipulation Methoden sind verfügbar im Zebrafisch. Diese bestehen aus Morpholinos (MO), die auch weit verbreitet in Frösche, Küken und Säugetiere neben im Zebrafisch10,11,12,13verwendet werden. MO hat effiziente Knockdown von Ziel-gen-Expression in den Erwachsenen Zebrafisch Fin, Gehirn und Netzhaut14,15,16,17,18,19. Gesperrt-Nuclein-Säure (LNA) ist eine weitere künstliche Oligonukleotid verwendet, um knock down endogenen Genexpression nicht nur in den Zebrafish Embryos, sondern auch Erwachsene tierorganen20,21,22, 23 , 24. das Fehlen von wirksamen Verlustfunktion-Methoden für Erwachsene Herzen bleibt jedoch ein Hindernis bei der Untersuchung der molekularen Mechanismen der Organregeneration. Vorhanden, kleine Molekül-Inhibitoren oder transgene Ausdruck der Dominant-Negative Mutanten dienen in erster Linie die Funktion eines bestimmten Gens oder Weg, seine Funktion in der Erwachsenen Zebrafisch Herz Regeneration25,26 zu studieren zu blockieren ,27. Jedoch nicht alle Gene oder Signalwege sind für diese Methoden anwendbar.
Kleine störende RNAs (SiRNAs) sind für die Verlustfunktion-Analyse im Säugetier-Zellen und Embryonen von Modellorganismen sowie Erwachsenen Organe verbreitet für präklinische Studien in der Tier-Modelle28,29,30 , 31 , 32. SiRNAs effektiv verwendet wurden, um Gene in Tumoren33,34,35 und in Kardiomyozyten36,37,38,39 zum Schweigen zu bringen ,40 über verschiedene Trägersysteme. Vor kurzem haben wir entwickelt effiziente SiRNA-gekapselte Nanopartikel gen-silencing inmitten regenerierende Erwachsene mit mehreren verschiedenen Nanopartikeln41,42,43, bietet ein neuartiges Instrument für die funktionelle Studien von Genen in Erwachsenen Zebrafisch Organe. Basierend auf unseren bisherigen Studien41,42,43, präsentieren hier wir eine einfache, praktische und doch leistungsfähige Protokoll für SiRNA Gen-silencing inmitten regenerierende Erwachsenen Zebrafisch mit f-PAMAM-PEG-R9 Dendrimere. Aldh1a2 (Aldehyde Dehydrogenase 1, Familienmitglied A2) Gen war hochreguliert nach Zebrafisch Apex Resektion und Ablation von Aldh1a2 blockiert die kardialen Regeneration44. Hier nehmen wir als Beispiel die Gen-Knockdown Effizienz vermittelt durch Nanopartikel verkapselt SiRNA Injektion zu testen aldh1a2 gen. Dieses Protokoll enthält ein Verfahren für Zebrafisch Herz Resektion, chemische Synthese von Nanopartikeln und eine Versandart auf SiRNA-gekapselte Nanopartikel in Erwachsenen Zebrafisch Herz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:765px;" width="765">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">tricaine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:193px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:180px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:193px;">S8AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sharp forcep</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">14098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">iridectomy scissors</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">elbow tweezers</td>
			<td style="width:180px;">Suzhou Liuliu</td>
			<td style="width:193px;">SE05Cr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">&#945;,&#969;-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py)</td>
			<td style="width:180px;">Biomatrik (Jiaxing) Inc.</td>
			<td style="width:193px;">5239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM)</td>
			<td style="width:180px;">Andrews ChemServices</td>
			<td style="width:193px;">AuCS-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">vacuum drying equipment</td>
			<td style="width:180px;">Yiheng</td>
			<td style="width:193px;">DZF-6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:193px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)</td>
			<td style="width:180px;">Alfar Aesar</td>
			<td style="width:193px;">51805-45-9</td>
			<td>Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Millipore</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">freeze dryer</td>
			<td style="width:180px;">Martin Christ</td>
			<td style="width:193px;">Alpha 2-4 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:193px;">AV400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:225px;">Deuterium oxide(D2O)</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td style="width:193px;">174611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR sample tube</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td>WG-1000-7-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 kDa MWCO ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sea salts</td>
			<td style="width:180px;">Instant Ocean&#174;</td>
			<td style="width:193px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart

Säugetiere haben eine sehr begrenzte Kapazität, das Herz nach Myokardinfarkt zu regenerieren. Auf der anderen Seite regeneriert der Erwachsenen Zebrabärbling seine Herz nach Apex Resektion oder Cryoinjury, so dass es ein wichtiger Modellorganismus für die Herz-Regeneration-Studie. Allerdings hat das Fehlen von Verlustfunktion Methoden für Erwachsene Organe Einblicke in die Mechanismen Herz Regeneration beschränkt. RNA-Interferenz über verschiedene Trägersysteme ist ein leistungsfähiges Werkzeug für Gene in Säugetierzellen und Modellorganismen zum Schweigen zu bringen. Wir haben bereits berichtet, dass SiRNA-gekapselte Nanopartikel erfolgreich Zellen eindringen und eine bemerkenswerte Gen-spezifischen Knockdown inmitten regenerierende Erwachsenen Zebrafisch zur Folge. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache, schnelle und effiziente Protokoll für die Dendrimer-vermittelten SiRNA Lieferung und gen-silencing inmitten regenerierende Erwachsenen Zebrafisch. Diese Methode bietet einen alternativen Ansatz zur Ermittlung von Genfunktionen in Erwachsenen Organen im Zebrafisch und auf andere Modellorganismen wie auch verlängert werden kann.

Um die Effizienz der Dendrimer-vermittelten SiRNA-Lieferung zu bestimmen, wir die Spitze des Ventrikels des Herzens Zebrafisch reseziert, dann ca. 10 µL Dendrimer nur (mock-Gruppe), Cy5-SiRNA nur (nackt-Gruppe) oder f-PAMAM-PEG-R9 Dendrimer-gekapselte injiziert Cy5-SiRNA (Cy5-SiRNA-Gruppe) Intrapleurally bzw. (Abbildung 2A-B). Das Fluoreszenzsignal war nachweisbar in den Herzen injiziert mit Dendrimer-gekapselte Cy5-SiRNA unter 3, 24 und 48 ...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Nanopartikel-vermittelten SiRNA Gen-silencing in Erwachsenen Zebrafisch-Herz

Es bleibt eine große Herausforderung, bedingte gen-Knockout oder effektive gen-Knockdown in Erwachsenen Zebrafisch Organe zu entwickeln. Hier berichten wir über ein Protokoll zur Durchführung Nanoparticle vermittelte SiRNA Gen-silencing inmitten der Erwachsenen Zebrafisch, wodurch eine neue Verlustfunktion-Methode zur Untersuchung Erwachsenen Organe im Zebrafisch und sonstige Modellorganismen.

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Großzebrafisch Embryonale Herz Dissection für Transkriptionsanalyse

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolierung und Kultur von Adult Zebrafisch brain-derived Neurosphären

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Vollständig-hängen konfokalen Mikroskopie für Erwachsene Ohr Haut: ein Modellsystem, Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Immunzelle Verteilung zu studieren

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...