Name: nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart
Uploaded: 2018-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

המחברים תודה ד ר ברוס IC תגובות ביקורתיות, לקרוא את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 ו 31521062), חברת AstraZeneca אסיה, ולא מתעוררים תרופה חדשנית שוק התפתחות מוקדמת.

כל ההליכים בבעלי חיים בשימוש פרוטוקול דג זברה אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה באוניברסיטת פקינג, אשר הוא מוכר באופן מלא על ידי האגודה הערכת ולדאוג הסמכה של מעבדה חיה.
1. הכנת פתרון Tricaine
<ol><li>כדי להכין פתרון מניות tricaine, להוסיף 400 מ"ג אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate אבק...

דג זברה הוא לגמרי מסוגל של רגנרציה מגוון איברים כולל את הלב למבוגרים5. בעוד שיטות מהונדס גנטית הם מפותח ללמוד פונקציות גנים העוברים של דג זברה, החוקרים עדיין עומדות בפנינו משימה מרתיעה של יצירת אללים mutant מותנה בדג זברה45,46. לפיכך, מוטציות דומיננט...

אוטם שריר הלב, הפכה איום בריאותי גדול, שמוביל נטל כלכלי עצום ברחבי העולם1. הלב יונקים בוגרים נכשלת לחדש, לחדש את cardiomyocytes לאיבוד בקנה מידה מאקרוסקופית אחרי הפציעה, שמוביל היווצרות של רקמות צלקת ואי ספיקת לב עוקבות. בניגוד יונקים, דג זברה הוא מסוגל הלב התחדשות, בעיקר באמצעות התפשטות שריר הלב חזקים לאחר סוגים שונים של פגיעה בלב, שהופך אותו אורגניזם מודל אידיאלי בשביל לחקור את המנגנונים המולקולריים של התחדשות לב 2,3,4,5,6,7,8. התחדשות הבסיסית של הלב דג זברה בפענוח מנגנוני אנדוגני הוא אזור מרגש של מחקר בחיפוש אחר הרומן אסטרטגיות טיפוליות לשפר את לב האדם התחדשות9.
מניפולציה גנטית שיטות זמינות דג זברה. אלה מורכב morpholinos (מו) אשר נמצאים בשימוש נרחב גם צפרדעים, צ'יק, יונקים חוץ דג זברה10,11,12,13. מו יש נוקאאוט יעיל היעד גנים סנפיר דג זברה למבוגרים, המוח ולאחר רשתית14,15,16,17,18,19. נעול-nucleic חומצה (מגבר קדם) היא עוד oligonucleotide מלאכותי המשמש כדי להפיל את ביטוי גנים אנדוגני לא רק בדג זברה עוברי, אלא גם למבוגרים אברי חית20,21,22, 23 , 24. אולם חוסר של שיטות יעילות אובדן-של-פונקציה עבור לבבות המבוגרים נותרה מכשול בפני הלומדים את המנגנונים המולקולריים של התחדשות איברים. מעכבי הנוכחי, מולקולה קטנה או ביטוי הטרנסגניים של מוטציות דומיננטה-שלילי משמשים בעיקר כדי לחסום את הפונקציה של גנים מסוימים או מסלול ללמוד את תפקידה דג זברה בוגרת הלב התחדשות25,26 ,27. עם זאת, לא כל הגנים או איתות המסלולים הינם ישימים עבור שיטות אלה.
RNAs הפרעה קטנה (siRNAs) נמצאים בשימוש נרחב עבור ניתוח אובדן-של-פונקציה בתרבית של תאים, העוברים של מודל אורגניזמים, כמו גם איברים למבוגרים עבור מחקרים פרה חיה מודלים28,29,30 , 31 , 32. siRNAs שימשו באופן יעיל להשתקת גנים גידולים33,34,35 , cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 באמצעות מערכות אספקה שונים. לאחרונה פיתחנו nanoparticle אנקפסולציה siRNA יעיל ג'ין-להחרשת בלב למבוגרים ההתחדשות באמצעות מספר חלקיקים שונים41,42,43, מתן כלי הרומן מחקרים פונקציונלי של גנים באיברים דג זברה למבוגרים. על סמך שלנו הקודם מחקרים41,42,43, כאן אנו מציגים עבור siRNA ג'ין להחרשת בלב דג זברה בוגרת ההתחדשות f-PAMAM-פג-R9 משתמש פרוטוקול פשוטה, פרקטית, עדיין חזק dendrimers. Aldh1a2 (אלדהיד דהידרוגנאז 1, בן משפחה A2) ג'ין היה upregulated לאחר כריתה איפקס דג זברה, אבלציה של Aldh1a2 חסם את התחדשות לב44. פה אנחנו לוקחים את aldh1a2 ג'ין לדוגמה כדי לבדוק את יעילות תמונות ציפורים גנים מתווכת על-ידי הזרקת אנקפסולציה nanoparticle siRNA. פרוטוקול זה מכיל הליך כריתה הלב דג זברה, סינתזה של חלקיקים של שיטת משלוח על חלקיקים אנקפסולציה siRNA ללב דג זברה למבוגרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:765px;" width="765">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">tricaine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:193px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:180px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:193px;">S8AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sharp forcep</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">14098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">iridectomy scissors</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">elbow tweezers</td>
			<td style="width:180px;">Suzhou Liuliu</td>
			<td style="width:193px;">SE05Cr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">&#945;,&#969;-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py)</td>
			<td style="width:180px;">Biomatrik (Jiaxing) Inc.</td>
			<td style="width:193px;">5239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM)</td>
			<td style="width:180px;">Andrews ChemServices</td>
			<td style="width:193px;">AuCS-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">vacuum drying equipment</td>
			<td style="width:180px;">Yiheng</td>
			<td style="width:193px;">DZF-6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:193px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)</td>
			<td style="width:180px;">Alfar Aesar</td>
			<td style="width:193px;">51805-45-9</td>
			<td>Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Millipore</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">freeze dryer</td>
			<td style="width:180px;">Martin Christ</td>
			<td style="width:193px;">Alpha 2-4 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:193px;">AV400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:225px;">Deuterium oxide(D2O)</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td style="width:193px;">174611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR sample tube</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td>WG-1000-7-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 kDa MWCO ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sea salts</td>
			<td style="width:180px;">Instant Ocean&#174;</td>
			<td style="width:193px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart

יונקים יש קיבולת מוגבלת מאוד לחדש את הלב לאחר אוטם שריר הלב. מצד שני, דג זברה בוגרת מחדש את הלב שלה לאחר כריתה איפקס או cryoinjury, שהופך אותו אורגניזם מודל חשוב עבור מחקר רגנרציה של הלב. עם זאת, העדר שיטות אובדן-של-תפקוד האיברים הבוגרים הגביל תובנות לגבי המנגנונים הלב התחדשות. התערבות ב RNA באמצעות מערכות אספקה שונים הוא כלי רב עוצמה עבור להשתיק גנים בתרבית של תאים ואורגניזמים מודל. אנחנו דיווחו בעבר כי חלקיקים אנקפסולציה siRNA בהצלחה הזן תאים וגוררים נוקאאוט גנטי ספציפי יוצאת דופן בלב דג זברה בוגרת ההתחדשות. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול פשוט, מהיר ויעיל עבור משלוח siRNA בתיווך דנדרימר ו ג'ין להחרשת בלב דג זברה בוגרת ההתחדשות. שיטה זו מספקת גישה חלופית לקביעת ג'ין פונקציות באיברים למבוגרים בדג זברה, ניתן להרחיב אורגניזמים מודל אחרים גם כן.

כדי לקבוע את היעילות של המשלוח siRNA בתיווך דנדרימר, אנחנו resected השיא של הנוזלים של הלב דג זברה, ואז מזריקים µL כ- 10 של דנדרימר בלבד (קבוצה מדומה), Cy5-siRNA בלבד (קבוצה עירום) או f-PAMAM-פג-R9 אנקפסולציה דנדרימר Intrapleurally Cy5-siRNA (קבוצת Cy5-siRNA), בהתאמה (איור 2א-ב). האות פ...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

בתיווך Nanoparticle siRNA ג'ין להחרשת בלב דג זברה למבוגרים

זה נשאר אתגר גדול לפתח מותנה נוקאאוט גנטי או יעיל ג'ין-נוקאאוט באיברים דג זברה למבוגרים. כאן אנחנו מדווחים על פרוטוקול עבור ביצוע siRNA בתיווך nanoparticle ג'ין להחרשת בלב דג זברה למבוגרים, ובכך מספק שיטה אובדן-של-פונקציה חדשה ללמוד. האיברים הבוגרים דג זברה ואורגניזמים אחרים מודל.

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

בידוד והתרבות של דג זברה למבוגרי מוח נגזר Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

הבידוד והתרבות של תאי Epicardial הראשית נגזר מן הלב האנושי למבוגרים ו עוברית דגימות

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...