Name: nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart
Uploaded: 2018-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. IC Bruce for kritiske kommentarer og lese manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 og 31521062), AstraZeneca Asia, og fremvoksende markedet Innovative medisin og tidlig utvikling.

Alle dyr prosedyrer brukes en sebrafisk protokoll godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved Peking University, som er fullt akkreditert av foreningen for vurdering og akkreditering av laboratoriet Animal Care.
1. forberedelse av Tricaine løsning
<ol><li>For å forberede tricaine lagerløsning, legge til 400 mg ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate pulver 97,9 mL destillert vann, og deretter legge 2.1 mL 1 M Tris (pH 9,5) å justere pH ~ 7. Lagre lager løsningen på 4 °...

Sebrafisk er fullt i stand til å regenerere forskjellige organer inkludert voksen hjertet5. Mens transgene og genetiske metoder er godt utviklet for å studere genet funksjoner i fosteret av sebrafisk, står etterforskere fortsatt overfor uoverkommelige generere betinget mutant alleler i sebrafisk45,46. Dermed transgene dominerende-negativ mutanter eller små molekyl hemmere brukes ofte til adressen genet funksjoner i voksen sebrafisk org...

Hjerteinfarkt er blitt en stor helserisiko, fører til en enorm økonomisk byrde rundt verden1. Voksen pattedyr hjertet ikke klarer å regenerere og fylle det tapte cardiomyocytes på makroskopisk skala etter skaden, fører til dannelse av arr vev og påfølgende hjertesvikt. I motsetning til pattedyr er sebrafisk dugelig av hjertet gjenfødelse, primært gjennom robust hjerteinfarkt spredning etter forskjellige typer hjertet skade, noe som gjør det til en ideell modell organisme for å undersøke molekylære mekanismer av hjertet gjenfødelse 2,3,4,5,6,7,8. Tyde endogene mekanismer er underliggende sebrafisk hjertet regenereringen et spennende område av forskning i jakten på romanen strategier forbedre hjerte gjenfødelse9.
Genetisk manipulasjon metoder er tilgjengelige i sebrafisk. Dette består av morpholinos (MO) som er også mye brukt i frosker, kylling og pattedyr foruten i sebrafisk10,11,12,13. MO har effektiv knockdown av målet genuttrykk i voksen sebrafisk fin, hjernen og netthinnen14,15,16,17,18,19. Låst-nukleinsyre acid (LNA) er en kunstig oligonucleotide brukes til å slå ned endogene genuttrykk ikke bare i sebrafisk embryoer, men også i voksen dyr organer20,21,22, 23 , 24. mangel på effektive tap-av-funksjon metoder for voksnes hjerter er imidlertid en hindring i å studere molekylære mekanismer av organ gjenfødelse. Stede, små-molekylet hemmere eller transgene uttrykk for dominerende-negativ mutanter brukes primært til å blokkere funksjonen til et bestemt gen eller sti å studere dens funksjon i voksen sebrafisk hjertet gjenfødelse25,26 ,27. Men ikke alle gener eller signalveier gjelder for disse metodene.
Små-konflikt RNAs (siRNAs) brukes for tap av funksjon analyse i pattedyrceller og embryo modell organismer, i tillegg til voksen organer for prekliniske studier i dyr modeller28,29,30 , 31 , 32. siRNAs har blitt effektivt brukt til taushet gener i svulster33,34,35 og cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 via forskjellige leveringssystemer. Nylig har utviklet vi effektive siRNA-innkapslet hydrogenion gen-stanse i regenererende voksen hjertet med flere forskjellige nanopartikler41,42,43, gir et romanen verktøy for funksjonell studier av gener i voksen sebrafisk organer. Basert på våre tidligere studier41,42,43, presenterer her vi en enkel, praktisk, men kraftig protokoll for siRNA gen-stanse i regenererende voksen sebrafisk hjertet bruke f-PAMAM-PEG-R9 dendrimers. Aldh1a2 (aldehyd dehydrogenase 1 familie, medlem A2) genet ble upregulated etter sebrafisk apex eksisjon og ablasjon av Aldh1a2 blokkert cardiac gjenfødelse44. Her tar vi aldh1a2 genet som et eksempel å teste genet knockdown effektiviteten formidlet av hydrogenion-kapslet siRNA injeksjon. Denne protokollen inneholder en fremgangsmåte for sebrafisk hjertet resection, syntese av nanopartikler og en leveringsmetode på siRNA-innkapslet nanopartikler inn voksen sebrafisk hjertet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:765px;" width="765">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">tricaine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:193px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:180px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:193px;">S8AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sharp forcep</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">14098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">iridectomy scissors</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">elbow tweezers</td>
			<td style="width:180px;">Suzhou Liuliu</td>
			<td style="width:193px;">SE05Cr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">&#945;,&#969;-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py)</td>
			<td style="width:180px;">Biomatrik (Jiaxing) Inc.</td>
			<td style="width:193px;">5239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM)</td>
			<td style="width:180px;">Andrews ChemServices</td>
			<td style="width:193px;">AuCS-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">vacuum drying equipment</td>
			<td style="width:180px;">Yiheng</td>
			<td style="width:193px;">DZF-6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:193px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)</td>
			<td style="width:180px;">Alfar Aesar</td>
			<td style="width:193px;">51805-45-9</td>
			<td>Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Millipore</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">freeze dryer</td>
			<td style="width:180px;">Martin Christ</td>
			<td style="width:193px;">Alpha 2-4 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:193px;">AV400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:225px;">Deuterium oxide(D2O)</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td style="width:193px;">174611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR sample tube</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td>WG-1000-7-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 kDa MWCO ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sea salts</td>
			<td style="width:180px;">Instant Ocean&#174;</td>
			<td style="width:193px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart

Pattedyr har en svært begrenset evne til å regenerere hjertet etter hjerteinfarkt. Derimot, regenererer voksen sebrafisk hjertet sitt etter apex resection eller cryoinjury, gjør det en viktig modell organisme for hjertet gjenfødelse studier. Men har mangel på tap av funksjon metoder for voksen organer begrenset innsikt i mekanismene bak hjertet gjenfødelse. RNA-interferens via forskjellige leveringssystemer er et kraftig verktøy for å stanse gener i pattedyrceller og modell organismer. Vi har tidligere rapportert at siRNA-innkapslet nanopartikler kunne angi celler og resultere i en bemerkelsesverdig gen-spesifikke knockdown i regenererende voksen sebrafisk hjertet. Her presenterer vi en enkel, rask og effektiv protokoll for dendrimer-mediert siRNA levering og slå av genet i regenererende voksen sebrafisk hjertet. Denne metoden gir en alternativ tilnærming for å bestemme genet funksjoner i voksen organer i sebrafisk og kan utvides til andre modellen organismer også.

For å fastslå effektiviteten av dendrimer-mediert siRNA levering, vi resected toppen av ventrikkel sebrafisk hjertet, deretter injisert ca 10 µL av dendrimer bare (mock gruppe), Cy5-siRNA bare (naken gruppe) eller f-PAMAM-PEG-R9 dendrimer-innkapslet Cy5-siRNA (Cy5-siRNA gruppe) intrapleurally, henholdsvis (figur 2A-B). Fluorescens signalet var i hjerter injisert med dendrimer-kapslet Cy5-siRNA på 3, 24 og 48 hpi (timer etter injeksjon), m...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Hydrogenion-mediert siRNA Gene-stanse i voksen sebrafisk hjerte

Det er fortsatt en stor utfordring å utvikle betinget gen-knockout eller effektiv gen-knockdown i voksen sebrafisk organer. Her kan vi rapportere en protokoll for utøvende hydrogenion-mediert siRNA gen-stanse i voksen sebrafisk hjerte, noe som gir en ny tap-av-funksjonen metoden for å studere voksen organer i sebrafisk og andre modellen organismer.

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nyre Regeneration i Adult Sebrafisk av Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Storskala Sebrafisk Embryonic Hjerte Dissection for Transkripsjonell Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolasjon og Culture of Adult Sebrafisk Brain-avledet Neurosfærer

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering av enkeltceller fra sebrafisk embryo

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membran Potensial i Live Zebrafish Embryoer

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Culture of Adult Transgene Sebrafisk Netthinne explants for Live-celle Imaging av multiphoton Mikros

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Isolasjon og kultur av primære Epicardial celler avledet fra menneskelige voksne og fosterets hjerte prøver

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...