Name: nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart
Uploaded: 2018-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Os autores agradecer Dr. IC Bruce comentários críticos e ler o manuscrito. Este trabalho foi financiado por doações da Nacional Natural Science Foundation da China (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 e 31521062), AstraZeneca, Ásia e emergente mercado inovador medicina e desenvolvimento precoce.

Todos os procedimentos de animal usado um zebrafish protocolo aprovado pelo Comitê de uso na Universidade de Pequim, que é totalmente credenciada pela Associação para avaliação e acreditação do cuidado de Animal de laboratório e institucional Cuidado Animal.
1. preparação da solução de tricaina
<ol><li>Para preparar solução estoque tricaina, adicionar 400 mg etil 3-aminobenzoato Metanossulfonato de pó para 97,9 mL de água destilada e em seguida, adicionar 2,1 mL de 1 M Tris ...

O peixe-zebra é plenamente capaz de regenerar uma variedade de órgãos, incluindo o coração adulto5. Enquanto métodos genéticos e transgênicos são bem desenvolvidos para estudar funções de genes em embriões de peixe-zebra, os investigadores ainda são confrontados com a difícil tarefa de geração de alelos mutantes condicionais no zebrafish45,46. Assim, a transgênicos dominante negativo mutantes ou inibidores da pequeno-molé...

Infarto do miocárdio tornou-se uma ameaça de saúde, levando a um enorme fardo econômico ao redor do mundo1. O coração dos mamíferos adulto falha regenerar e reabastecer o cardiomyocytes perdido na escala macroscópica após a lesão, levando à formação de cicatriz tecidos e subsequente insuficiência cardíaca. Ao contrário dos mamíferos, o peixe-zebra é capaz de regeneração do coração, principalmente através da proliferação robusta miocárdica após diferentes tipos de lesão do coração, tornando-se um organismo modelo ideal para investigar os mecanismos moleculares da regeneração do coração 2,3,4,5,6,7,8. Decifrando os mecanismos endógenos regeneração de coração de zebrafish subjacente é uma excitante área de pesquisa na busca de novas estratégias terapêuticas melhorar a regeneração de coração humano9.
Métodos de manipulação genética estão disponíveis no zebrafish. Estes consistem de morpholinos (MO) que são também amplamente utilizados em rãs, pintinho e mamíferos além no zebrafish10,11,12,13. MO tem eficiente nocaute da expressão do gene alvo no zebrafish Adulto barbatana, cérebro e retina14,15,16,17,18,19. Ácido nucleico bloqueado (LNA) é outro oligonucleotide artificial usada para derrubar a expressão do gene endógeno não apenas em embriões de peixe-zebra, mas também em órgãos de animais adultos20,21,22, 23 , 24. no entanto, a falta de métodos eficazes de perda-de-função para corações dos adultos continua a ser um obstáculo no estudo dos mecanismos moleculares de regeneração do órgão. No presentes, pequeno-molécula inibidores ou expressão transgênica dominante negativo mutantes são principalmente usados para bloquear a função de um determinado gene ou caminho para estudar a sua função no zebrafish adulto coração regeneração25,26 ,,27. No entanto, nem todos os genes e vias de sinalização são aplicáveis para esses métodos.
Interferindo de pequenos RNAs (siRNAs) são amplamente utilizados para a análise de perda-de-função de células de mamíferos e embriões de organismos-modelo, bem como órgãos adultos para estudos pré-clínicos em animais modelos28,29,30 , 31 , 32. siRNAs foram efetivamente usadas para silenciar genes em tumores33,34,35 e em cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 através de diferentes sistemas de entrega. Recentemente, desenvolvemos eficientes encapsulado siRNA nanoparticle-silenciamento de genes no coração adulto regeneradora usando vários diferentes nanopartículas41,42,43, fornecendo uma nova ferramenta para estudos funcionais de genes em órgãos adultos do zebrafish. Baseado em nossos anteriores estudos41,42,43, aqui apresentamos um protocolo simples, prático, e potente para siRNA silenciamento no coração adulto zebrafish regeneradora usando f-PAMAM-PEG-R9 dendrímeros. Aldh1a2 (aldeído desidrogenase 1, membro da família A2) gene foi upregulated após a ressecção do ápice de zebrafish e ablação de Aldh1a2 bloqueou a regeneração cardíaca44. Aqui tomamos aldh1a2 gene como um exemplo para testar a eficiência de gene "knockdown" mediada pela injeção de siRNA nanoparticle-encapsulado. Este protocolo contém um procedimento para ressecção de coração zebrafish, síntese química de nanopartículas e um método de entrega sobre nanopartículas siRNA-encapsulado no coração de adultos do zebrafish.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:765px;" width="765">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">tricaine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:193px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:180px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:193px;">S8AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sharp forcep</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">14098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">iridectomy scissors</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">elbow tweezers</td>
			<td style="width:180px;">Suzhou Liuliu</td>
			<td style="width:193px;">SE05Cr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">&#945;,&#969;-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py)</td>
			<td style="width:180px;">Biomatrik (Jiaxing) Inc.</td>
			<td style="width:193px;">5239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM)</td>
			<td style="width:180px;">Andrews ChemServices</td>
			<td style="width:193px;">AuCS-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">vacuum drying equipment</td>
			<td style="width:180px;">Yiheng</td>
			<td style="width:193px;">DZF-6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:193px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)</td>
			<td style="width:180px;">Alfar Aesar</td>
			<td style="width:193px;">51805-45-9</td>
			<td>Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Millipore</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">freeze dryer</td>
			<td style="width:180px;">Martin Christ</td>
			<td style="width:193px;">Alpha 2-4 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:193px;">AV400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:225px;">Deuterium oxide(D2O)</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td style="width:193px;">174611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR sample tube</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td>WG-1000-7-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 kDa MWCO ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sea salts</td>
			<td style="width:180px;">Instant Ocean&#174;</td>
			<td style="width:193px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart

Mamíferos têm uma capacidade muito limitada para regenerar o coração após infarto do miocárdio. Por outro lado, o zebrafish adulto regenera seu coração após a ressecção do ápice ou cryoinjury, tornando-se um organismo importante modelo para estudo de regeneração do coração. No entanto, a falta de métodos de perda-de-função para órgãos adultos restrito insights sobre os mecanismos subjacentes a regeneração do coração. Interferência do RNA através de diferentes sistemas de entrega é uma ferramenta poderosa para o silenciamento de genes em células de mamíferos e organismos modelo. Informamos anteriormente que nanopartículas de siRNA-encapsulado com êxito inserir células e resultam em uma notável derrubada de gene-específico no coração adulto zebrafish regeneradora. Aqui, apresentamos um protocolo simples, rápido e eficiente para a entrega de siRNA mediada por dendrímeros e silenciamento de genes no coração adulto zebrafish regeneradora. Este método fornece uma abordagem alternativa para determinar as funções do gene em órgãos adultos no zebrafish e pode ser estendido para outros organismos modelo também.

Para determinar a eficiência da entrega mediada por dendrímeros siRNA, ressecados do ápice do ventrículo do coração zebrafish, então injetado cerca de 10 µ l de dendrímeros só (grupo simulado), Cy5-siRNA só (grupo nu) ou f-PAMAM-PEG-R9 dendrímeros encapsulado Cy5-siRNA (grupo de siRNA-Cy5) intrapleurally, respectivamente (Figura 2A-B). O sinal de fluorescência foi detectável nos corações injetados com encapsulado dendrímeros ...

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Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

SiRNA Nanoparticle-mediada-silenciamento no coração de Zebrafish adulto

Continua a ser um grande desafio para desenvolver condicional gene nocaute ou eficaz knockdown do gene-em órgãos adultos do zebrafish. Aqui nós relatamos um protocolo para desempenho siRNA nanoparticle-mediada silenciamento no coração de adultos do zebrafish, proporcionando assim um novo método de perda-de-função para estudar órgãos adultos no zebrafish e outros organismos-modelo.

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Biologia do Desenvolvimento

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Em larga escala Zebrafish Embryonic Coração de dissecação para a análise transcricional

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolamento e Cultura de neuroesferas Zebrafish Adulto derivado do cérebro

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

O isolamento e a cultura de células primárias de Epicárdica derivado de espécimes de coração adulto e Fetal humano

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Toda a montagem em microscopia Confocal para pele da orelha do adulto: um sistema de modelo para estudar a morfogênese Neuro-vasculares de ramificação e distribuição de células imunes