Name: nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart
Uploaded: 2018-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Авторы благодарят д-р Брюс IC для критических замечаний и читать рукопись. Эта работа была поддержана субсидий из национального естественных наук фонд Китая (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 и 31521062), AstraZeneca Азии и возникающие рынок инновационной медицины и раннего развития.

Все животные процедуры используется данио рерио протоколом, утвержденным на институциональный уход животных и использования Комитетом в Пекинском университете, который полностью аккредитован ассоциации оценки и аккредитации лабораторных животных уход.
1. Приготовлени...

Данио рерио полностью способен регенерировать различных органов, включая взрослых сердца5. Хотя трансгенных и генетические методы развитая для изучения функций генов в эмбрионов у рыбок данио, следователи по-прежнему сталкивается с сложной задачей генерации условных мут...

Инфаркт миокарда стал серьезной угрозой, приводит к огромным бременем вокруг мира1. Сердце взрослого человека млекопитающих не регенерировать и пополнить потерянные кардиомиоцитов в макроскопических масштабах после травмы, приводит к образованию рубцовой ткани и последующие сердечной недостаточности. В отличие от млекопитающих данио рерио способен регенерации сердца, главным образом через надежные миокарда распространения после различных видов травмы сердца, что делает его организма идеальная модель для изучения молекулярных механизмов регенерации сердца 2,3,4,5,6,,78. Расшифровка местных механизмов базовой регенерации сердца данио рерио является захватывающей области исследований в поисках роман терапевтических стратегий для улучшения человеческого сердца регенерации9.
В zebrafish доступны методы генетической манипуляции. Они состоят из морфолиновая (MO), которые также широко используются в лягушек, цыпленок и млекопитающих, кроме данио рерио10,11,12,13. MO имеет эффективное нокдаун целевого выражения гена в плавник взрослых рыбок данио, мозга и сетчатки14,,1516,,1718,19. К морю нуклеиновых кислот (LNA) является другой искусственный олигонуклеотида, используемый для сбить эндогенного ген выражение не только в zebrafish эмбриона, но и в, органов взрослых животных20,,2122 23 , 24. Однако отсутствие эффективных методов потери функции для взрослых сердец по-прежнему является препятствием в изучение молекулярных механизмов регенерации органов. В настоящее время, мелкомолекулярных ингибиторы или трансгенных выражение Доминант отрицательных мутантов главным образом используются для блокировки функции определенного гена или путь для изучения его функции в взрослых рыбок данио сердце регенерации25,26 ,27. Однако не все гены или сигнальных путей применимы для этих методов.
Вмешательства малые РНК (малые интерферирующие РНК) широко используются для анализа потери функции в mammalian клеток и эмбрионов модельных организмов, а также органов взрослых доклинические исследования в животных моделей28,29,30 , 31 , 32. Малые интерферирующие РНК эффективно использовались для молчание генов в опухоли33,,3435 и кардиомиоцитов36,,3738,39 ,40 через различных систем доставки. Недавно мы разработали эффективных малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц сайленсинга генов в самом восстанавливающий взрослых, используя несколько различных наночастиц41,,4243, обеспечивая новый инструмент для функциональные исследования генов в органах взрослых рыбок данио. Основываясь на наших предыдущих исследований41,42,43, здесь мы представляем простой, практические, но мощный протокол для малых интерферирующих РНК сайленсинга генов в самом восстанавливающий взрослых рыбок данио, с помощью f ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ-PEG-R9 дендримеров. Aldh1a2 (альдегид дегидрогеназа 1, член семьи A2) ген был upregulated после резекции верхушки данио рерио и абляции Aldh1a2 заблокирован сердца регенерации44. Здесь мы берем гена aldh1a2 в качестве примера для проверки эффективности нокдаун гена при посредничестве наночастиц инкапсулированное siRNA инъекции. Этот протокол содержит процедуру для резекции сердце данио рерио, химического синтеза наночастиц и метод доставки на малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц в сердце взрослого данио рерио.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:765px;" width="765">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">tricaine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:193px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:180px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:193px;">S8AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sharp forcep</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">14098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">iridectomy scissors</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">elbow tweezers</td>
			<td style="width:180px;">Suzhou Liuliu</td>
			<td style="width:193px;">SE05Cr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">&#945;,&#969;-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py)</td>
			<td style="width:180px;">Biomatrik (Jiaxing) Inc.</td>
			<td style="width:193px;">5239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM)</td>
			<td style="width:180px;">Andrews ChemServices</td>
			<td style="width:193px;">AuCS-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">vacuum drying equipment</td>
			<td style="width:180px;">Yiheng</td>
			<td style="width:193px;">DZF-6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:193px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)</td>
			<td style="width:180px;">Alfar Aesar</td>
			<td style="width:193px;">51805-45-9</td>
			<td>Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Millipore</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">freeze dryer</td>
			<td style="width:180px;">Martin Christ</td>
			<td style="width:193px;">Alpha 2-4 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:193px;">AV400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:225px;">Deuterium oxide(D2O)</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td style="width:193px;">174611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR sample tube</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td>WG-1000-7-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 kDa MWCO ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sea salts</td>
			<td style="width:180px;">Instant Ocean&#174;</td>
			<td style="width:193px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart

Млекопитающие имеют весьма ограниченные возможности для восстановления сердца после инфаркта миокарда. С другой стороны взрослых рыбок данио восстанавливает свое сердце после резекции верхушки или cryoinjury, что делает его организма важной моделью для изучения регенерации сердца. Однако отсутствие потери функции методов для органов взрослых ограничила идеи в механизмы, лежащие в основе регенерации сердца. Система РНК-интерференции через различные системы доставки является мощным инструментом для сайленсинга генов в клетках млекопитающих и модельных организмов. Мы уже ранее сообщали, что малых интерферирующих РНК инкапсулированное наночастиц успешно ввести клетки и привести к замечательным нокдаун ген специфического в самом восстанавливающий взрослых рыбок данио. Здесь мы представляем простой, быстрый и эффективный протокол для доставки дендример опосредованной siRNA и сайленсинга генов в самом восстанавливающий взрослых рыбок данио. Этот метод обеспечивает альтернативный подход для определения функции гена в органов взрослых в данио рерио и может быть распространено на другие модели организмов также.

Для определения эффективности доставки дендример опосредованной siRNA, мы резецируется Апекс желудочке сердца данио рерио, затем вводят около 10 мкл только катионные (макет группы), Cy5-siRNA только (голые группа) или f ПОЛИАМИДОАМИННЫМИ-PEG-R9 инкапсулированные дендример Intrapleur...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Наночастицы опосредованной siRNA сайленсинга генов в сердце взрослого человека данио рерио

Это остается серьезной проблемой разработки условной гена нокаут или эффективным-нокдаун гена в органах взрослых рыбок данио. Здесь мы приводим протокол для исполняющих наночастиц опосредованной siRNA сайленсинга генов в сердце взрослого данио рерио, обеспечивая тем самым новый метод функция потерь для изучения органов взрослых в данио рерио и других модельных организмов.

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Почки Регенерация у взрослых данио рерио по гентамицина поражении

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Крупномасштабные данио рерио эмбриональных Сердце Вскрытие для транскрипционных анализа

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Выделение и культура взрослых данио мозга, полученных из нейросферах

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Выделение и характеристика отдельных клеток из эмбрионов данио рерио

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Мембранный потенциал монокристалла монокристалла в живых эмбрионах данио

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Культура взрослых Трансгенные данио Ретинального эксплантов для живых клеток изображений многофотонной микроскопии

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Изоляции и культуры клеток первичного эпикардиальной, производный от сердца человека взрослых и плода образцов

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Целом гора Confocal микроскопии для уха взрослого кожи: модель системы для изучения нейро сосудистые ветвления морфогенеза и иммунных клеток распределения