Name: nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart
Uploaded: 2018-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Författarna tackar Dr. IC Bruce för kritiska kommentarer och läsa manuskriptet. Detta arbete stöds av bidrag från National Natural Science Foundation Kina (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 och 31521062), AstraZeneca Asien, och framväxande marknaden innovativ medicin och tidiga utveckling.

Alla djur förfaranden används ett zebrafiskar protokoll godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén på Peking University, som är fullt ackrediterad av föreningen för bedömning och ackreditering av laboratorium djur vård.
1. beredning av Tricaine lösning
<ol><li>För att förbereda tricaine stamlösning, lägga 400 mg etyl 3-aminobensoat methanesulfonate pulver till 97,9 mL destillerat vatten och tillsätt därefter 2,1 mL 1 M Tris (pH 9,5) att justera pH till ...

Zebrafiskar är fullt kapabel att regenerera en mängd organ inklusive de vuxna hjärta5. Medan transgena och genetiska metoder är väl utvecklade för att studera gen funktioner i embryon av zebrafiskar, inför utredare fortfarande den skrämmande uppgiften att generera villkorlig muterade alleler i zebrafiskar45,46. Således, transgena dominant-negativ mutanter eller småmolekylär hämmare används ofta till adress gen funktioner i vux...

Hjärtinfarkt har blivit en större hälsorisk, leder till en enorm ekonomisk belastning runt om världen1. Vuxna däggdjur hjärtat inte att regenerera och fylla på förlorad hjärtmuskelcellerna i makroskopisk skala efter skadan, vilket leder till bildandet av ärrvävnad och efterföljande hjärtsvikt. Till skillnad från däggdjur är zebrafiskar kapabel att hjärtat regenerering, främst genom robust hjärtinfarkt spridning efter olika typer av hjärt-skada, vilket gör det en ideal modellerar organism för att undersöka hjärtat regenerering molekylära mekanismer 2,3,4,5,6,7,8. Dechiffrera de endogena mekanismerna är underliggande zebrafiskar hjärtat regenerering ett spännande område för forskning i sökandet efter nya terapeutiska strategier för att förbättra mänskliga hjärtat regenerering9.
Det finns genetisk manipulation metoder i zebrafiskar. Dessa består av morpholinos (MO) som används också allmänt i grodor, chick och däggdjur förutom i zebrafiskar10,11,12,13. MO har effektiv Nedslagning av målet genuttryck i vuxen zebrafiskar fin, hjärna och näthinna14,15,16,17,18,19. Låst-nucleic acid (LNA) är en annan konstgjord oligonukleotiden brukade slå ner endogena genernas uttryck inte bara i zebrafiskar embryon, utan också i vuxna djur organ20,21,22, 23 , 24. bristen på effektiva förlust-av-funktion metoder för vuxna hjärtan är dock fortfarande ett hinder i att studera molekylära mekanismer för orgel regenerering. På nuvarande, småmolekylär hämmare eller transgena uttrycket av dominant-negativ mutanter används främst för att blockera funktionen av en viss gen eller väg att studera dess funktion i vuxen zebrafiskar hjärtat regenerering25,26 ,27. Dock inte alla gener eller signalvägar som är tillämpliga för dessa metoder.
Små-störande RNAs (siRNAs) används allmänt för förlust-av-funktion analysen i däggdjursceller och embryon av modellorganismer, liksom vuxna organ för prekliniska studier på djur modeller28,29,30 , 31 , 32. siRNAs har använts effektivt att tysta gener i tumörer33,34,35 och hjärtmuskelceller36,37,38,39 ,40 via olika leveranssystem. Nyligen har utvecklat vi effektiva siRNA-inkapslat nanopartikel-nedtystning i regenererande vuxen hjärtat med flera olika nanopartiklar41,42,43, som tillhandahåller ett nytt verktyg för funktionella studier av gener i vuxen zebrafiskar organ. Baserat på våra tidigare studier41,42,43, presenterar här vi en enkel, praktisk, men ändå kraftfulla protokoll för siRNA nedtystning i regenererande vuxen zebrafiskar hjärtat med f-PAMAM-PEG-R9 tåååålamooooooood. Aldh1a2 (aldehyd dehydrogenas 1, familjemedlem A2) genen var uppreglerad efter zebrafiskar apex resektion och ablation av Aldh1a2 blockerade de kardiella regenerering44. Här tar vi aldh1a2 gen som exempel att testa gen knockdown effektivitet medieras av nanopartiklar-inkapslat siRNA injektion. Detta protokoll innehåller en procedur för zebrafiskar hjärtat resektion, kemisk syntes av nanopartiklar och en leveransmetod på siRNA-inkapslat nanopartiklar i vuxen zebrafiskar hjärta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:765px;" width="765">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">tricaine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:193px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:180px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:193px;">S8AP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sharp forcep</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">14098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">iridectomy scissors</td>
			<td style="width:180px;">WPI</td>
			<td style="width:193px;">501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">elbow tweezers</td>
			<td style="width:180px;">Suzhou Liuliu</td>
			<td style="width:193px;">SE05Cr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">&#945;,&#969;-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py)</td>
			<td style="width:180px;">Biomatrik (Jiaxing) Inc.</td>
			<td style="width:193px;">5239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM)</td>
			<td style="width:180px;">Andrews ChemServices</td>
			<td style="width:193px;">AuCS-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">vacuum drying equipment</td>
			<td style="width:180px;">Yiheng</td>
			<td style="width:193px;">DZF-6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:193px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)</td>
			<td style="width:180px;">Alfar Aesar</td>
			<td style="width:193px;">51805-45-9</td>
			<td>Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Millipore</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">freeze dryer</td>
			<td style="width:180px;">Martin Christ</td>
			<td style="width:193px;">Alpha 2-4 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:193px;">AV400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:225px;">Deuterium oxide(D2O)</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td style="width:193px;">174611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">NMR sample tube</td>
			<td>J&#38;K</td>
			<td>WG-1000-7-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 kDa MWCO ultrafiltration tube</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:193px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">sea salts</td>
			<td style="width:180px;">Instant Ocean&#174;</td>
			<td style="width:193px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle-mediated sirna gene-silencing in adult zebrafish heart

Däggdjur har en mycket begränsad förmåga att regenerera hjärtat efter hjärtinfarkt. Däremot, återskapar de vuxna zebrafiskar dess hjärta efter apex resektion eller cryoinjury, vilket gör det till ett viktigt modellerar organism för hjärtat regenerering studie. Avsaknaden av förlust-av-funktion metoder för vuxna organ har dock begränsat insikter om mekanismerna bakom hjärtat regenerering. RNA-interferens via olika leveranssystem är ett kraftfullt verktyg för tysta gener i däggdjursceller och modellorganismer. Vi har tidigare rapporterat att siRNA-inkapslat nanopartiklar framgångsrikt komma in i cellerna och resultera i en anmärkningsvärd gen-specifika knockdown i regenererande vuxen zebrafiskar hjärtat. Här presenterar vi en enkel, snabb och effektiv protokollet för dendrimer-medierad siRNA delivery och nedtystning i regenererande vuxen zebrafiskar hjärtat. Denna metod ger en alternativ metod för att bestämma gen funktioner i vuxna organ i zebrafiskar och kan utökas till andra modellorganismer samt.

För att avgöra effektiviteten i dendrimer-medierad siRNA leverans, vi resected apexen av ventrikeln zebrafiskar hjärta, sedan injiceras cirka 10 µL av dendrimer endast (mock grupp), Cy5-siRNA endast (nakna grupp) eller f-PAMAM-PEG-R9 dendrimer-inkapslat Cy5-siRNA (Cy5-siRNA grupp) intrapleurally, respektive (figur 2A-B). Fluorescens signalen var detekterbart i hjärtan injiceras med dendrimer-inkapslat Cy5-siRNA på 3, 24 och 48 hpi (timm...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Nanopartikel-medierad siRNA nedtystning i vuxen zebrafiskar hjärtat

Det är fortfarande en stor utmaning att utveckla villkorlig gen-knockout eller effektiva gene-knockdown i vuxen zebrafiskar organ. Här rapporterar vi ett protokoll för presterande nanopartikel-medierad siRNA-nedtystning i vuxen zebrafiskar hjärtat, vilket ger en ny förlust-av-funktion-metod för att studera vuxna organ i zebrafiskar och andra modellorganismer.

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Njure Regeneration i vuxen Zebrafish av Gentamicin inducerad skada

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Storskalig Zebrafish Embryonala Hjärta Dissection för Transkriptionell Analys

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolering och kultur av vuxna Zebrafish Brain-härledda Neuro

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering och karakterisering av enskilda celler från zebrafiskembryon

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membran Potential i Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Kultur av vuxna Transgena Zebrafish retinal explants för Live-cell imaging av multifotonMicrosCopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Isolering och kultur av primära epikardiell celler från mänskliga vuxen och fostrets hjärta exemplar

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...