Name: multimodal bioluminescent and positronic-emission tomography/computational tomography imaging of multiple myeloma bone marrow xenografts in nog mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice at JoVE.c

Questo lavoro è stato supportato da una grant1I01BX001532 di merito VA dagli Stati Uniti Dipartimento di veterani affari laboratorio ricerca biomedica e sviluppo servizio (uccelli) di P.F. ed E.C. riconosce il supporto dal servizio VA clinica scienza R & S ( I01CX001388 premio di merito) e riabilitazione VA R & D Service (Merit Award I01RX002604). Ulteriore supporto è venuto da una sovvenzione di seme facoltà di UCLA a J.K. Questi contenuti non rappresentano necessariamente le opinioni di US Department of Veterans Affairs o il governo degli Stati Uniti.

Tutte le procedure degli animali descritte di seguito sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) del sistema Greater Los Angeles VA sanitario e sono state eseguite in condizioni sterili ed esenti da patogeni.
1. preparazione di cellule che esprimono Luciferase 8226 (8226-LUC)
<ol><li>Mantenere la linea cellulare umana MM, 8226, in RPMI-1640 supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina a 37 ° C in atmosfera umidificata cont...

<ol>
	<li>Raab, M. S., Podar, K., Breitkreutz, I., Richardson, P. G., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Myeloma.">Multiple Myeloma.</a> The Lancet. 374 (9686), 324-339 (2009).</li><li>Galson, D. L., Silbermann, R., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Multiple+Myeloma+Bone+Disease.">Mechanisms of Multiple Myeloma Bone Disease.</a> BoneKEy Reports. 1, 135 (2012).</li><li>Anderson, K. C., Carrasco, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Myeloma.">Pathogenesis of Myeloma.</a> Annual Review of Pathology. 6, 249-274 (2011).</li><li>Reagan, M. R., Rosen, C. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Novel+Mouse+Model+of+Multiple+Myeloma+and+Its+Use+in+Preclinical+Therapeutic+Assessment.">Characterization of a Novel Mouse Model of Multiple Myeloma and Its Use in Preclinical Therapeutic Assessment.</a> PLoS One. 8 (2), e57641 (2013).</li><li>Gould, S. J., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+Luciferase+as+a+Tool+in+Molecular+and+Cell+Biology.">Firefly Luciferase as a Tool in Molecular and Cell Biology.</a> Analytical Biochemistry. 175 (1), 5-13 (1988).</li><li>Czernin, J., Phelps, M. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+Vivo+Molecular+Imaging+Probe+(18)F-Annexin+B1+for+Apoptosis+Detection+by+Pet/Ct:+Preparation+and+Preliminary+Evaluation.">An in Vivo Molecular Imaging Probe (18)F-Annexin B1 for Apoptosis Detection by Pet/Ct: Preparation and Preliminary Evaluation.</a> Apoptosis. 18 (2), 238-247 (2013).</li></ol>

Nonostante una varietà di modelli preclinici dello xenotrapianto di MM6,9,11,12,13, la capacità di studiare le interazioni tumore/BM all'interno del microambiente BM rimane difficile 14. le tecniche qui descritte consentono il rapido e riproducibile engraftment delle cellule di tumori 8226-LUC nello scheletro dei topi NOG.
<p clas...

MM è una malattia incurabile costituita da plasma maligno B-cellule che infiltrano il BM e causare la distruzione dell'osso, l'anemia, insufficienza renale e infezione. MM rende fino al 10% - 15% di tutte le neoplasie ematologiche1 ed è il cancro più frequente di coinvolgere lo scheletro2. Lo sviluppo del MM deriva dalla trasformazione oncogena longeve delle cellule di plasma che vengono stabilite in centri germinali dei tessuti linfoidi prima alla fine homing al BM3. Il BM è caratterizzata da nicchie altamente eterogenei; tra cui componenti cellulari diversi e critici, regioni di basso pO2 (ipossia), ricca vascolarizzazione, complesse matrici extracellulari e reti di citochine e fattori di crescita, che contribuiscono a MM dimostato4. Così, lo sviluppo di un modello di xenotrapianto MM diffuso caratterizzato da tumori che sono rigorosamente innestati in BM sarebbe uno strumento molto potente e clinicamente rilevante per lo studio MM patologia in vivo5,6. Tuttavia, numerosi ostacoli tecnici possono limitare l'efficacia della maggior parte dei modelli dello xenotrapianto, che li rende costosi e difficili da applicare. Questo include problemi connessi con il engraftment coerenti e riproducibili del tumore all'interno della nicchia di BM, un tempo prolungato per lo sviluppo del tumore e le limitazioni nella capacità di direttamente osservare e misurare le variazioni della crescita del tumore/sopravvivenza senza dover sacrificio di topi nel corso dell'esperimento7,8.
Questo protocollo utilizza un modello di xenotrapianto modificate che inizialmente è stato sviluppato da Miyakawa et al. 9, in cui una sfida per via endovenosa (IV) con cellule di mieloma si traduce in "diffusi" tumori che costantemente e riproducibile attecchire nei topi BM di NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG)10. La visualizzazione in situ di questi tumori è raggiunto mediante la trasfezione stabile della 8226 umano linea cellulare MM con un allele LUC e in serie misurano l'evoluzione della BLI prodotta da queste cellule di tumore engrafted6. D'importanza, questo modello può essere ampliato per utilizzare vari altri che esprimono LUC MM linee cellulari umane (ad es., U266 e OPM2) con una tendenza simile a specificamente interdigitate nello scheletro dei topi NOG. L'identificazione dei tumori da bioluminescenti imaging dei topi è seguita misurando la captazione del radiofarmaci sonde (ad esempio 18F-FDG) di PET/CT. insieme, in questo modo ulteriore caratterizzazione dei critici biochimico vie (cioè, le alterazioni nel metabolismo, cambiamenti in ipossia e l'induzione di apoptosi) all'interno del microambiente del tumore/BM. I principali punti di forza di questo modello può essere evidenziate dalla disponibilità di una vasta gamma di sonde radioattive, bioluminescenti e fluorescente e marcatori che possono essere usati per studiare la progressione MM e patologia in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>8226 human myeloma cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mice (NOG)</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>5557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoGlo Luciferin substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxyprobe-1Kit</td>
			<td>HPL</td>
			<td>HP1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD45 (clone H130)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555483</td>
			<td>Used for flow cytometry to identify human CD45+ tumor cells in BM exudate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-human CD45 (clone D3F8Q)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>70527</td>
			<td>Primary antibody used for Immunohistochemistry of excised bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-rabbit IgG (HRP conjugated)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab205718</td>
			<td>Seconday antibody used for Immunohistochemistry of excised bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL4.5 Luciferase Reporter Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofie G8 PET/CT Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal bioluminescent and positronic-emission tomography/computational tomography imaging of multiple myeloma bone marrow xenografts in nog mice

Mieloma multiplo (MM) tumori attecchire nel midollo osseo (BM) e la loro sopravvivenza e la progressione dipendono da complesse interazioni molecolari e cellulari che esistono all'interno di questo microambiente. Ancora il microambiente BM non può essere facilmente replicato in vitro, che potenzialmente limita la rilevanza fisiologica di molti modelli sperimentali in vitro ed ex vivo . Questi problemi possono essere superati utilizzando un modello di xenotrapianto in cui luciferasi (LUC)-cellule trasfettate 8226 MM saranno specificamente interdigitate nello scheletro del mouse. Quando questi topi sono dato il substrato appropriato, D-luciferina, gli effetti della terapia sulla crescita del tumore e la sopravvivenza può essere analizzata misurando i cambiamenti nelle immagini bioluminescenti (BLI) prodotto dai tumori in vivo. Questi dati BLI combinato con analisi di tomografia (PET/CT) emissione positronica tomografia/calcolo utilizzando l'indicatore metabolico 2-deoxy - 2-(18F) fluoro-D-glucosio (18F-FDG) è utilizzato per monitorare i cambiamenti nel metabolismo del tumore nel tempo. Queste piattaforme imaging consentono misurazioni non invasive più all'interno del microambiente del tumore/BM.

Negli studi pilota iniziali, iniezioni IV delle cellule 8226-LUC in topi NOD/SCID non hanno sviluppato i tumori BM-engrafted MM, anche se squamose MM tumori erano facilmente formati (100% tasso di successo). Al contrario, sfide IV con 8226 cellule nei topi NOG generato (nel raggio di 15-25 giorni) tumori nello scheletro (e soli raramente formati tumori nei tessuti muscolo-scheletrici, come il fegato o la milza). Poiché i tumori nello scheletro visivamente non potrebbero essere confermati...

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Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Formazione immagine di tomografia multimodale bioluminescenti ed emissione positronica tomografia/computazionale di mieloma multiplo del midollo osseo xenotrapianti in topi NOG

Qui usiamo bioluminescenti, raggi x ed emissione di positroni tomografia/computato tomografia imaging per studiare l'attività come inibitore di mTOR urta i tumori del midollo osseo-engrafted mieloma in un modello dello xenotrapianto. Questo permette analisi fisiologicamente pertinenti, non invasivo e multimodale dell'effetto anti-mieloma di terapie designando i tumori del midollo osseo-engrafted mieloma in vivo.

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave sul ruolo del micro-ambiente del midollo osseo e sulla sopravvivenza dei tumori del mieloma innestati. Il vantaggio principale di questa procedura è che può essere applicato a studi longitudinali anti-farmaci e utilizzato per saggiare più vie biochimiche in modo non invasivo. Il giorno dell'esperimento lavare per la prima volta le 8226 cellule trasfatte luciferasi tre volte in PBS ghiacciato a 200 RCF per cinque minuti per centrifigazione e rimescolare il pellet in PBS freddo ghiaccio fresco a cinque volte dieci al sesto cellule per 200 microlitri di PBS ghiacciato per topo.Successivamente confermare una mancanza di risposta al dito del dito in un topo NOG anestetizzato di quattro o sei settimane e applicare un unguento oftalmico agli occhi dell'animale. Caricare le cellule in una siringa per insulina da un millilitro dotata di un ago calibro 26. Iniettare l'intero volume di cellule nella vena di coda dell'animale, prima di riportare il mouse nella sua gabbia, monitorando fino al pieno recupero.Da dieci a venti giorni dopo la sfida, iniettare ogni animale innestato con 200 microlitri di substrato D-luciferina di grado in vivo in intraperitonealy salina sterile. Posizionare gli animali anestetizzati in posizione supina in un piccolo sistema di imaging animale entro 5-10 minuti dall'iniezione. Misurare la luminosità media in aree di interesse selezionate all'interno del software di imaging corrispondente.Per una terapia mirata dei tumori della Luciferasi 8226, dopo aver misurato la bioluminescenza di base in ogni animale come appena dimostrato, randomizzare gli animali in gruppi di trattamento e trattare ogni topo con una serie di iniezione IP di 200 microlitri di Temsirolimus o un controllo salino. Misurare l'attività della Luciferasi due volte a settimana e tracciare i cambiamenti nella bioluminescenza nel tempo. Per misurare i cambiamenti nel metabolismo tumorale, rimuovere prima il cibo dalla gabbia domestica dei topi per 24 ore per evitare l'assorbimento di fludeossiglucosio non specifico in eccesso.Il giorno successivo diluire da 500 a 100 microcuries di 18 sonda fludeossiglucosio radioetichettata fluoro in salina sterile ad un volume finale di 100 microlitri per topo e registrare il tempo e l'attività delle sonde con un calibratore di dose. Quando le sonde sono pronte, posizionare il primo animale anestetizzato su una pastiglia riscaldante con la testa rivolta verso l'interno e utilizzare una siringa per insulina da millilitro schermata dotata di un ago calibro 26 per iniettare 100 microlitri della sonda nella vena della coda. Misurare la radioattività residua nell'ago e nella siringa con il calibratore di dose e annotare l'attività e il tempo.Quindi misurare l'attività del fludeossiglucosio radioetichettato in regioni selezionate di interesse che corrispondono ai tumori innestati in un piccolo sistema di imaging PET CT animale. Un'innesto tumorale del midollo osseo di successo può essere confermata dall'imaging a bioluminescenza come dimostrato. L'imaging seriale di più animali può essere utilizzato per visualizzare la distribuzione del midollo osseo innestato tumori multipli del mieloma.Inoltre, l'analisi ottica dei raggi X mostra una determinazione rapida e non invasiva della posizione esatta e della distribuzione dei tumori multipli del mieloma all'interno dello scheletro del topo. La bioluminescenza prodotta da queste cellule tumorali innestati può essere misurata in modo seriale e non invasivo per valutare i cambiamenti nella crescita tumorale. Inoltre, la sopravvivenza dei topi trattati con l'inibitore mTOR Temsirolimus può essere monitorata e l'emissione di positroni e l'analisi tomografica computerizzata per l'assorbimento di fludeossiglucosio radioetichettato tumorale possono essere utilizzate per dimostrare i cambiamenti mediati del Temsirolimus nel metabolismo del glucosio.Durante l'esecuzione di questa procedura è importante iniettare le celle IEV. Abbiamo scoperto che la mancata iniezione delle cellule nella vena provoca la formazione di cellule tumorali non innestati dal midollo vicino al sito di iniezione. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'immunoistochimica e la micro-TC possono essere utilizzati per affrontare domande sull'impatto dei tumori sull'architettura ossea e sui componenti cellulari e molecolari non tumorali dell'ambiente del midollo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Atterramento condizionale dell'espressione genica in linee cellulari del cancro per studiare il reclutamento dei monociti/macrofagi al microambiente tumorale

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

Effetti doppi di fattori derivati da cellule di Melanoma su differenziazione adipociti del midollo osseo

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescenza tomografia molecolare per l'Imaging In Vivo di Glioblastoma xenotrapianti

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Repression of Multiple Myeloma Cell Growth In Vivo by Single-wall Carbon Nanotube (SWCNT)-delivered MALAT1 Antisense Oligos

Repression of Multiple Myeloma Cell Growth In Vivo by Single-wall Carbon Nanotube SWCNT-delivered MALAT1 Antisense Oligos

Repressione della crescita delle cellule di mieloma multiplo In Vivo di nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT)-consegnato oligo antisenso MALAT1

The single-wall carbon nanotube (SWCNT) is a new type of nanoparticle, which has been used to deliver multiple kinds of drugs into cells, such as ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Imaging in vivo e quantitazione dell'ospite risposta angiogenica in Xenogrfts tumore zebrati

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Istituzione e analisi di organidi tridimensionali (3D) Derivati dagli spettri della metastasi ossea del cancro della prostata del paziente e dai loro xenoinfi

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Screening farmacologico del paziente primario - Tumore derivato Xenotrapianto nel pesce zebra

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Imaging dinamico di cellule T del recettore dell'antigene chimerico con [18F] tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Imaging simultaneo e rilevamento basato sulla citometria a flusso di marcatori di senescenza fluorescenti multipli in cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...