Name: multimodal bioluminescent and positronic-emission tomography/computational tomography imaging of multiple myeloma bone marrow xenografts in nog mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice at JoVE.c

Este trabalho foi apoiado por um mérito VA grant1I01BX001532 dos Estados Unidos Departamento de veteranos dos assuntos laboratório pesquisa biomédica e serviço de desenvolvimento (aves) de P.F. e E.C. reconhece apoio do (VA clínica ciência R & D serviço I01CX001388 prêmio de mérito) e reabilitação VA R & D serviço (Merit Award I01RX002604). Maior apoio veio de um subsídio de sementes da faculdade UCLA para J.K. Estes conteúdos não representam necessariamente as opiniões nos departamento de assuntos de veteranos ou o governo dos EUA.

Todos os animais procedimentos descritos a seguir foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) do sistema de saúde de VA maior Los Angeles e foram realizados sob condições estéreis e isentos de agentes patogénicos.
1. preparação de Luciferase-expressando 8226 células (8226-LUC)
<ol><li>Manter a linha de celular humana MM, 8226, em RPMI-1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina a 37 ° C numa atmosf...

<ol>
	<li>Raab, M. S., Podar, K., Breitkreutz, I., Richardson, P. G., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Myeloma.">Multiple Myeloma.</a> The Lancet. 374 (9686), 324-339 (2009).</li><li>Galson, D. L., Silbermann, R., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Multiple+Myeloma+Bone+Disease.">Mechanisms of Multiple Myeloma Bone Disease.</a> BoneKEy Reports. 1, 135 (2012).</li><li>Anderson, K. C., Carrasco, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Myeloma.">Pathogenesis of Myeloma.</a> Annual Review of Pathology. 6, 249-274 (2011).</li><li>Reagan, M. R., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+Bone+Marrow+Niche:+Translational+Insights+and+Cancer-Driven+Dysfunction.">Navigating the Bone Marrow Niche: Translational Insights and Cancer-Driven Dysfunction.</a> Nature Reviews Rheumatology. 12 (3), 154-168 (2016).</li><li>Frost, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Target+of+Rapamycin+Inhibitors+Induce+Tumor+Cell+Apoptosis+in+Vivo+Primarily+by+Inhibiting+Vegf+Expression+and+Angiogenesis.">Mammalian Target of Rapamycin Inhibitors Induce Tumor Cell Apoptosis in Vivo Primarily by Inhibiting Vegf Expression and Angiogenesis.</a> Journal of Oncology. 2013, 897025 (2013).</li><li>Mysore, V. S., Szablowski, J., Dervan, P. B., Frost, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-Binding+Molecule+Targeting+the+Adaptive+Hypoxic+Response+in+Multiple+Myeloma+Has+Potent+Antitumor+Activity.">A DNA-Binding Molecule Targeting the Adaptive Hypoxic Response in Multiple Myeloma Has Potent Antitumor Activity.</a> Molecular Cancer Research. 14 (3), 253-266 (2016).</li><li>Podar, K., Chauhan, D., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow+Microenvironment+and+the+Identification+of+New+Targets+for+Myeloma+Therapy.">Bone Marrow Microenvironment and the Identification of New Targets for Myeloma Therapy.</a> Leukemia. 23 (1), 10-24 (2009).</li><li>Campbell, R. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Novel+Mouse+Model+of+Multiple+Myeloma+and+Its+Use+in+Preclinical+Therapeutic+Assessment.">Characterization of a Novel Mouse Model of Multiple Myeloma and Its Use in Preclinical Therapeutic Assessment.</a> PLoS One. 8 (2), e57641 (2013).</li><li>Gould, S. J., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+Luciferase+as+a+Tool+in+Molecular+and+Cell+Biology.">Firefly Luciferase as a Tool in Molecular and Cell Biology.</a> Analytical Biochemistry. 175 (1), 5-13 (1988).</li><li>Czernin, J., Phelps, M. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+Vivo+Molecular+Imaging+Probe+(18)F-Annexin+B1+for+Apoptosis+Detection+by+Pet/Ct:+Preparation+and+Preliminary+Evaluation.">An in Vivo Molecular Imaging Probe (18)F-Annexin B1 for Apoptosis Detection by Pet/Ct: Preparation and Preliminary Evaluation.</a> Apoptosis. 18 (2), 238-247 (2013).</li></ol>

Apesar de uma variedade de modelos pré-clínicos xenoenxertos de MM6,9,11,12,13, a capacidade de estudar as interações de tumor/BM dentro do microambiente BM continua a ser difícil 14. as técnicas descritas aqui permitem a rápida e reprodutível enxertia das células de tumores 8226-LUC no esqueleto de ratos NOG.
<p class="jov...

MM é uma doença incurável, composta de plasma maligno B-células que se infiltrar o BM e causar a destruição óssea, anemia, disfunção renal e infecção. MM faz acima de 10% - 15% de todas as malignidades hematológicas1 e é o câncer mais frequente que envolvem o esqueleto2. O desenvolvimento de MM decorre a transformação oncogênica de plasmócitos long-lived estabelecidas nos centros germinativos dos tecidos linfoides antes eventualmente de orientação para o BM3. O BM é caracterizado por nichos altamente heterogêneos; incluindo diversos e críticos componentes celulares, regiões de baixa pO2 (hipóxia), extensa vascularização, matrizes extracelulares complexas e redes de citocinas e fator de crescimento, os quais contribuem para MM tumorgenesis4. Assim, o desenvolvimento de um modelo de enxerto heterólogo MM disseminado caracterizado por tumores que são estritamente incorporados no BM seria uma ferramenta muito poderosa e clinicamente relevante para estudar MM patologia na vivo5,6. No entanto, numerosos obstáculos técnicos podem limitar a eficácia da maioria dos modelos de enxerto heterólogo, tornando-os caros e difíceis de aplicar. Isso inclui problemas associados com a enxertia de tumor consistentes e reprodutíveis dentro do nicho de BM, um tempo prolongado para o desenvolvimento do tumor e limitações na capacidade diretamente observar e medir as alterações de crescimento/sobrevivência de tumor sem a necessidade de sacrifica os ratos durante o curso do experimento7,8.
Este protocolo usa um modelo de xenoenxertos modificado que foi inicialmente desenvolvido por Miyakawa et al 9, em que um desafio (IV) por via venosa com pilhas do myeloma resulta em "disseminada" tumores que consistentemente e reproducibly engraft no BM de NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG) ratos10. A visualização em situ destes tumores é conseguida pelo transfection estável de 8226 humana MM linhagem celular com um alelo LUC e serialmente, medir as mudanças no BLI produzido por estas células de tumor engrafted6. Importante, este modelo pode ser expandido para utilizar vários outras LUC-expressando humano MM linhas celulares (por exemplo, U266 e OPM2) com uma propensão similar ao engraft especificamente no esqueleto de ratos NOG. A identificação dos tumores por bioluminescente imagem dos ratos é seguida por medir a absorção de sondas radiofarmacêuticos (como 18F-FDG) por PET/CT. juntos, isto permite a caracterização adicional de crítica bioquímico vias (ou seja, alterações no metabolismo, alterações em hipóxia e a indução de apoptose) dentro o microambiente do tumor/BM. Principais pontos positivos deste modelo podem ser realçados pela disponibilidade de uma vasta gama de sondas radiolabeled, bioluminescentes e fluorescentes e marcadores que podem ser usados para estudar a progressão de MM e patologia em vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>8226 human myeloma cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mice (NOG)</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>5557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoGlo Luciferin substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxyprobe-1Kit</td>
			<td>HPL</td>
			<td>HP1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD45 (clone H130)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555483</td>
			<td>Used for flow cytometry to identify human CD45+ tumor cells in BM exudate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-human CD45 (clone D3F8Q)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>70527</td>
			<td>Primary antibody used for Immunohistochemistry of excised bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-rabbit IgG (HRP conjugated)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab205718</td>
			<td>Seconday antibody used for Immunohistochemistry of excised bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL4.5 Luciferase Reporter Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofie G8 PET/CT Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal bioluminescent and positronic-emission tomography/computational tomography imaging of multiple myeloma bone marrow xenografts in nog mice

Mieloma múltiplo (MM) tumores engraft na medula óssea (BM) e sua sobrevivência e progressão dependem de complexas interações moleculares e celulares que existem dentro este microambiente. Ainda o microambiente BM não pode ser facilmente replicado em vitro, que potencialmente limita a relevância fisiológica de muitos modelos experimentais in vitro e ex vivo . Esses problemas podem ser superados utilizando um modelo de enxerto heterólogo em qual luciferase (LUC)-células transfectadas de 8226 MM serão especificamente engraft do esqueleto de rato. Quando esses ratos são dadas o substrato apropriado, D-luciferina, os efeitos da terapia no crescimento do tumor e sobrevivência podem ser analisados medindo as alterações nas imagens bioluminescentes (BLI) produzido pela tumores em vivo. Este dados BLI combinado com análise de tomografia computadorizada (PET/CT) tomografia de emissão positrônica/computacional usando o marcador metabólico 2-deoxy - 2-(18F) fluoro-D-glicose (18F-FDG) é usado para monitorar as alterações no metabolismo do tumor ao longo do tempo. Essas plataformas de imagem permitem várias medições não-invasivas dentro o microambiente do tumor/BM.

Em estudos-piloto iniciais, injeções IV de células 8226-LUC em camundongos NOD/SCID não desenvolveu tumores BM-engrafted MM, embora escamosas MM tumores foram facilmente formaram (100% de sucesso). Em contraste, os desafios IV com 8226 células em camundongos NOG gerado (dentro de 15-25 dias) tumores no esqueleto (e só raramente formados tumores no tecido não-esquelético, tais como o fígado ou baço). Já tumores do esqueleto não podem ser confirmados visualmente examinando fisic...

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Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Imagem de tomografia computadorizada multimodal bioluminescentes e emissão positrônica Tomography/computacional de mieloma múltiplo Xenografts de medula óssea em camundongos NOG

Aqui usamos bioluminescentes, raio-x e positron-emissão calculado a tomografia computadorizada/tomografia computadorizada de imagem para estudar a atividade como a inibição de mTOR impactos tumores de medula óssea-incorporada do mieloma múltiplo em um modelo de transplante. Isto permite análises fisiologicamente relevantes, não-invasivo e multimodais do efeito antimieloma de terapias direcionamento incorporada a medula óssea mieloma tumores na vivo.

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Este método pode ser usado para responder a perguntas-chave sobre o papel do microambi ambiente da medula óssea e a sobrevivência de tumores de mieloma engrafados. A principal vantagem deste procedimento é que ele pode ser aplicado a estudos antidrogas longitudinais e usado para avaliar múltiplas vias bioquímicas de forma não invasiva. No dia do experimento, lave pela primeira vez as células transfactadas luciferase 8226 luciferase três vezes em PBS gelado a 200 RCF por cinco minutos por centorifigação e resuspense a pelota em PBS gelado fresco em cinco vezes dez a seis células por 200 microliters de PBS frio por rato.Em seguida, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo em um rato NOG anestésimo de seis semanas de idade e aplique pomada oftálmica aos olhos do animal. Coloque as células em uma seringa de insulina de um mililitro equipada com uma agulha calibre 26. Injete todo o volume de células na veia traseira do animal, antes de devolver o rato à sua gaiola, monitorando até a recuperação completa.Dez a vinte dias após o desafio, injete cada animal engrafado com 200 microlitadores de substrato in vivo grau D-luciferin em solução salina estéril intraperitonealy. Coloque os animais anestesiados na posição supina em um pequeno sistema de imagem animal dentro de 5 a 10 minutos da injeção. Meça o brilho médio em regiões selecionadas de interesse dentro do software de imagem correspondente.Para a terapia-alvo dos 8226 tumores luciferase, Depois de medir a bioluminescência de base em cada animal como apenas demonstrado, randomizar os animais em grupos de tratamento e tratar cada camundongo com uma série de 200 injeção ip microliter de Temsirolimus ou um controle salino. Meça a atividade da Luciferase duas vezes por semana e trace as mudanças na bioluminescência ao longo do tempo. Para medir as alterações no metabolismo tumoral, primeiro remova os alimentos da gaiola doméstica dos camundongos por 24 horas para evitar o excesso de absorção de fludeoxicose radiolabeled sem especificação.No dia seguinte diluir 500 a 100 microcuries de 18 sondas fludeoxicadas radiolabeled Fludeoxyglucose fludeoxyglucose fluorina em soro fisiológico estéril a um volume final de 100 microliters por rato e registrar o tempo e a atividade das sondas com um calibrador de dose. Quando as sondas estiverem prontas coloque o primeiro animal anestesiado em uma almofada de aquecimento com a cabeça virada para longe e use uma seringa de insulina de um mililitro blindada equipada com uma agulha calibre 26 para injetar 100 microliters da sonda na veia traseira. Meça a radioatividade residual na agulha e seringa com o calibrador de dose e observe a atividade e o tempo.Em seguida, meça a atividade de Fludeoxicogracose radiolabeled em regiões de interesse selecionadas que correspondem aos tumores engrafados em um pequeno sistema de imagem pet ct animal. Um enenxerto de tumor de medula óssea bem sucedido pode ser confirmado por bioluminescência, como demonstrado. Imagens seriais de múltiplos animais podem ser usadas para visualizar a distribuição dos tumores de mieloma múltiplos da medula óssea.Além disso, a análise de raios-X de imagem óptica mostra uma determinação rápida e não invasiva da localização exata e distribuição dos tumores múltiplos de mieloma dentro do esqueleto do camundongo. A bioluminescência produzida por essas células tumorais engrafadas pode ser medida de forma serial e não invasiva para avaliar as alterações no crescimento do tumor. Além disso, a sobrevivência de camundongos tratados com o inibidor de mTOR Temsirolimus pode ser monitorada e a emissão de pósitrons e a análise de tomografia computadorizada para captação de fludeoxicose radiolabeled tumoral podem ser usadas para demonstrar as alterações mediadas por Temsirolimus no metabolismo da glicose.Durante a realização deste procedimento é importante injetar as células IEV. Descobrimos que a falha em injetar as células na veia resulta na formação de células tumorais não-meduladas perto do local da injeção. Após esse procedimento, outros métodos como a imunohistoquímica e a microCcidade podem ser usados para responder a questões sobre o impacto dos tumores na arquitetura óssea e os componentes celulares e moleculares não tumorais do ambiente medular.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Knockdown condicional de expressão gênica em linhas de células de câncer para estudar o recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do Tumor

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Pesquisa do câncer

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

Efeitos duplos de fatores derivado de células de Melanoma na diferenciação de adipócitos de medula óssea

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescência Molecular Tomography para a imagem latente na Vivo de Glioblastoma Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Repression of Multiple Myeloma Cell Growth In Vivo by Single-wall Carbon Nanotube (SWCNT)-delivered MALAT1 Antisense Oligos

Repression of Multiple Myeloma Cell Growth In Vivo by Single-wall Carbon Nanotube SWCNT-delivered MALAT1 Antisense Oligos

Repressão de crescimento de células do mieloma múltiplo na Vivo por nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT)-entregue MALAT1 antisentido Oligos

The single-wall carbon nanotube (SWCNT) is a new type of nanoparticle, which has been used to deliver multiple kinds of drugs into cells, such as ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

In vivo Imaging e Quantitation da resposta angiogênica hospedeira em xenoenxertos de tumor de zebrafish

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Estabelecimento e Análise de Organoides Tridimensionais (3D) derivados de amostras de metástase óssea do câncer de próstata paciente e seus Xenoenxertos

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Imagem dinâmica das células T do receptor de antígeno quimérico com [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Tomografia Computadorizada

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Detecção simultânea baseada em imagens e flutometria de marcadores de senescência fluorescentes múltiplas em células cancerígenas senescentes induzidas por terapia

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...