Name: multimodal bioluminescent and positronic-emission tomography/computational tomography imaging of multiple myeloma bone marrow xenografts in nog mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice at JoVE.c

Este trabajo fue apoyado por un grant1I01BX001532 de mérito VA desde los Estados Unidos Departamento de los veteranos asuntos laboratorio investigación biomédica y desarrollo servicio (BLRDS) y P.F., C.E. reconoce apoyo de la (VA ciencia clínica R & D servicio Merecen Premio I01CX001388) y rehabilitación VA R & D servicio (mérito Premio I01RX002604). Más apoyo vino de una donación de semillas Facultad de UCLA a J.K. Estos contenidos no representan necesariamente las opiniones de la nos Department of Veterans Affairs o el gobierno.

Todos los procedimientos animales que se describe a continuación fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la mayor Los Angeles VA Healthcare system y se realizaron bajo condiciones estériles y libre de patógenos.
1. preparación de 8226 células expresan luciferasa (8226-LUC)
<ol><li>Mantener la línea celular humana de MM, 8226, en Medio RPMI-1640 suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y penicilina-estreptomicina de 1% a 37 ° C en una atmó...

<ol>
	<li>Raab, M. S., Podar, K., Breitkreutz, I., Richardson, P. G., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Myeloma.">Multiple Myeloma.</a> The Lancet. 374 (9686), 324-339 (2009).</li><li>Galson, D. L., Silbermann, R., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Multiple+Myeloma+Bone+Disease.">Mechanisms of Multiple Myeloma Bone Disease.</a> BoneKEy Reports. 1, 135 (2012).</li><li>Anderson, K. C., Carrasco, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Myeloma.">Pathogenesis of Myeloma.</a> Annual Review of Pathology. 6, 249-274 (2011).</li><li>Reagan, M. R., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+Bone+Marrow+Niche:+Translational+Insights+and+Cancer-Driven+Dysfunction.">Navigating the Bone Marrow Niche: Translational Insights and Cancer-Driven Dysfunction.</a> Nature Reviews Rheumatology. 12 (3), 154-168 (2016).</li><li>Frost, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Target+of+Rapamycin+Inhibitors+Induce+Tumor+Cell+Apoptosis+in+Vivo+Primarily+by+Inhibiting+Vegf+Expression+and+Angiogenesis.">Mammalian Target of Rapamycin Inhibitors Induce Tumor Cell Apoptosis in Vivo Primarily by Inhibiting Vegf Expression and Angiogenesis.</a> Journal of Oncology. 2013, 897025 (2013).</li><li>Mysore, V. S., Szablowski, J., Dervan, P. B., Frost, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-Binding+Molecule+Targeting+the+Adaptive+Hypoxic+Response+in+Multiple+Myeloma+Has+Potent+Antitumor+Activity.">A DNA-Binding Molecule Targeting the Adaptive Hypoxic Response in Multiple Myeloma Has Potent Antitumor Activity.</a> Molecular Cancer Research. 14 (3), 253-266 (2016).</li><li>Podar, K., Chauhan, D., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow+Microenvironment+and+the+Identification+of+New+Targets+for+Myeloma+Therapy.">Bone Marrow Microenvironment and the Identification of New Targets for Myeloma Therapy.</a> Leukemia. 23 (1), 10-24 (2009).</li><li>Campbell, R. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Novel+Mouse+Model+of+Multiple+Myeloma+and+Its+Use+in+Preclinical+Therapeutic+Assessment.">Characterization of a Novel Mouse Model of Multiple Myeloma and Its Use in Preclinical Therapeutic Assessment.</a> PLoS One. 8 (2), e57641 (2013).</li><li>Gould, S. J., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+Luciferase+as+a+Tool+in+Molecular+and+Cell+Biology.">Firefly Luciferase as a Tool in Molecular and Cell Biology.</a> Analytical Biochemistry. 175 (1), 5-13 (1988).</li><li>Czernin, J., Phelps, M. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+Vivo+Molecular+Imaging+Probe+(18)F-Annexin+B1+for+Apoptosis+Detection+by+Pet/Ct:+Preparation+and+Preliminary+Evaluation.">An in Vivo Molecular Imaging Probe (18)F-Annexin B1 for Apoptosis Detection by Pet/Ct: Preparation and Preliminary Evaluation.</a> Apoptosis. 18 (2), 238-247 (2013).</li></ol>

A pesar de una gran variedad de modelos de xenoinjerto preclínica de MM6,9,11,12,13, la capacidad para el estudio de las interacciones del tumor/BM en el microambiente del BM sigue siendo difícil 14. las técnicas aquí descritas permiten el engraftment rápido y reproducible de las células de tumores 8226-LUC en el esqueleto de los ...

MM es una enfermedad incurable de plasma maligno de células B que infiltran el BM y causar destrucción ósea, anemia, insuficiencia renal e infección. MM hasta 10% - 15% de todas las malignidades hematológicas1 y es el cáncer más frecuente participación del esqueleto2. El desarrollo de la m proviene de la transformación oncogénica de larga vida células plasmáticas que se establezcan en los centros germinales de los tejidos linfoides antes de finalmente autoguiado hacia el blanco a la BM3. El BM se caracteriza por nichos altamente heterogéneas; como críticos y diversos componentes celulares, regiones de baja pO2 (hipoxia), extensa vascularización, complejas matrices extracelulares y redes citocinas y factor de crecimiento, todos los cuales contribuyen al tumorgenesis MM4. Así, el desarrollo de un modelo de xenoinjerto MM diseminado caracterizado por tumores que son estrictamente engrafted en el BM sería una herramienta muy potente y clínicamente relevante para el estudio de MM patología en vivo5,6. Sin embargo, numerosos obstáculos técnicos pueden limitar la efectividad de la mayoría de las modelos de xenoinjerto, haciéndolos costosos y difíciles de aplicar. Esto incluye problemas relacionados con el engraftment tumor consistente y reproducible dentro del nicho de BM, un prolongado desarrollo del tumor, y limitaciones en la capacidad de observar y medir los cambios de crecimiento del tumor/supervivencia sin tener que directamente sacrificio de ratones durante el curso del experimento7,8.
Este protocolo utiliza un modelo de xenoinjerto modificado que fue desarrollado inicialmente por Miyakawa et al. 9, en el que un desafío (IV) intravenosa con células de mieloma produce tumores que engraft consistente y reproducible en la BM de NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG) ratones10"diseminada". La visualización en situ de estos tumores se logra mediante la transfección estable de la línea de celular MM humano 8226 con un alelo LUC y en serie, medir los cambios en el BLI producido por estas células tumorales implantada del6. Lo importante, este modelo puede ser ampliado para utilizar varias otras LUC-expresión humana MM líneas celulares (por ejemplo, U266 y OPM2) con una propensión similar a engraft específicamente en el esqueleto de los ratones NOG. La identificación de los tumores por imágenes bioluminiscentes de los ratones es seguida por la medición de la captación de radiofármacos sondas (como la 18F-FDG) por PET/CT. juntos, esto permite la caracterización adicional de crítica bioquímico vías (es decir, alteraciones en el metabolismo, cambios en la hipoxia y la inducción de apoptosis) en el microambiente del tumor/BM. Las principales fortalezas de este modelo se pueden destacar la disponibilidad de una amplia gama de sondas radiactivos, bioluminiscentes y fluorescentes y marcadores que pueden utilizarse para estudiar la progresión MM y patología en vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>8226 human myeloma cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mice (NOG)</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>5557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoGlo Luciferin substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxyprobe-1Kit</td>
			<td>HPL</td>
			<td>HP1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD45 (clone H130)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555483</td>
			<td>Used for flow cytometry to identify human CD45+ tumor cells in BM exudate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-human CD45 (clone D3F8Q)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>70527</td>
			<td>Primary antibody used for Immunohistochemistry of excised bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-rabbit IgG (HRP conjugated)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab205718</td>
			<td>Seconday antibody used for Immunohistochemistry of excised bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL4.5 Luciferase Reporter Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofie G8 PET/CT Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal bioluminescent and positronic-emission tomography/computational tomography imaging of multiple myeloma bone marrow xenografts in nog mice

Mieloma múltiple (MM) tumores engraft en la médula (BM) y su supervivencia y progresión dependen de complejas interacciones moleculares y celulares que existen dentro de este microambiente. Sin embargo el microambiente BM no puede ser fácilmente replicada en vitro, que potencialmente limita la relevancia fisiológica de muchos modelos experimentales in vitro y ex vivo . Estos problemas pueden ser superados mediante la utilización de un modelo de xenoinjerto en que luciferasa (LUC)-células transfected 8226 MM se engraft específicamente en el esqueleto del ratón. Cuando estos ratones se les da el sustrato apropiado, D-luciferin, los efectos del tratamiento sobre el crecimiento del tumor y la supervivencia pueden ser analizadas midiendo cambios en las imágenes bioluminiscentes (BLI) producida por los tumores in vivo. Estos datos BLI combinaron con tomografía de emisión positrónica/computacional análisis de tomografía (PET/CT) utilizando el marcador metabólico 2-deoxy - 2-(18F) fluoro-D-glucosa (18F-FDG) se utiliza para monitorizar los cambios en el metabolismo del tumor con el tiempo. Estas plataformas de proyección de imagen permiten varias mediciones no invasivas en el microambiente del tumor/BM.

En estudios piloto iniciales, las inyecciones IV de células LUC 8226 en ratones NOD/SCID no desarrollaron tumores m m BM-engrafted, aunque forman squamous MM tumores eran fácilmente (100% de éxito). En cambio, desafíos IV con 8226 células en ratones NOG generan (dentro de 15-25 días) tumores en el esqueleto (y sólo raramente formados tumores en tejidos no esqueléticos, como el hígado o bazo). Puesto que los tumores en el esqueleto no se podían confirmar visualmente examinando f?...

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Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Proyección de imagen de tomografía multimodal bioluminiscente y emisión positrónica tomografía/computacional de xenoinjertos de médula ósea del mieloma múltiple en ratones NOG

Aquí utilizamos bioluminiscente, rayos x y emisión de positrones la tomografía/computado tomografía la proyección de imagen para estudiar cómo inhibidor mTOR actividad impactos tumores mieloma engrafted de médula ósea en un modelo de xenoinjerto. Esto permite fisiológicamente relevantes, no invasivo y multimodales análisis del efecto anti-mieloma de tratamientos contra tumores mieloma médula engrafted en vivo.

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Este método se puede utilizar para responder preguntas clave sobre el papel del microambiente de la médula ósea y la supervivencia de los tumores de mieloma injertado. La principal ventaja de este procedimiento es que se puede aplicar a estudios longitudinales anti-drogas y se utiliza para ensayor múltiples vías bioquímicas de una manera no invasiva. El día del experimento lave por primera vez las 8226 células transfactadas Luciferase tres veces en PBS helado a 200 RCF durante cinco minutos por centrifigación y resuspend el pellet en PBS frío fresco a cinco veces diez a las sextas células por cada 200 microlitros de PBS frío de hielo por ratón.A continuación, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del y el dedo del dedo del otro y aplicar un ratón NOG de cuatro a seis semanas de edad y aplicar un ungán oftálmico a los ojos del animal. Cargue las células en una jeringa de insulina de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26. Inyectar todo el volumen de células en la vena de la cola del animal, antes de devolver el ratón a su jaula, monitoreando hasta la recuperación completa.Diez a veinte días después del desafío, inyectar cada animal injertado con 200 microlitros de sustrato de D-luciferina grado in vivo en la salina estéril intraperitonealy. Coloque los animales anestesiados en la posición supina en un sistema de imágenes de animales pequeños dentro de los 5 a 10 minutos de la inyección. Mida el resplandor medio en determinadas regiones de interés dentro del software de imágenes correspondiente.Para la terapia dirigida de los tumores 8226 Luciferase, Después de medir la bioluminiscencia basal en cada animal como acaba de demostrarse, aleatorizar a los animales en grupos de tratamiento y tratar cada ratón con una serie de 200 microlitro inyección IP de Temsirolimus o un control salino. Mida la actividad de Luciferase dos veces por semana y trace los cambios en la bioluminiscencia a lo largo del tiempo. Para medir los cambios en el metabolismo tumoral, primero retire los alimentos de la jaula casera de los ratones durante 24 horas para evitar el exceso de absorción de fludeoxidasa radiomarcada en exceso.Al día siguiente diluir de 500 a 100 microcuries de 18 sondas de Fludeoxglucosa radiomarcadas por flúor en solución salina estéril a un volumen final de 100 microlitros por ratón y registrar el tiempo y la actividad de las sondas con un calibrador de dosis. Cuando las sondas estén listas, coloque al primer animal anestesiado en una almohadilla calefactora con la cabeza hacia otro lado y utilice una jeringa de insulina blindada de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26 para inyectar 100 microlitros de la sonda en la vena de la cola. Mida la radiactividad residual en la aguja y la jeringa con el calibrador de dosis y observe la actividad y el tiempo.A continuación, mida la actividad radiomarcada de la fludeoxglucosa en determinadas regiones de interés que corresponden a los tumores injertados en un sistema de imágenes por TC PET animal pequeño. Un injerto exitoso de tumores de médula ósea puede confirmarse mediante imágenes de bioluminiscencia como se ha demostrado. Se pueden utilizar imágenes en serie de varios animales para visualizar la distribución de los tumores de mieloma múltiple injertados en la médula ósea.Además, el análisis óptico de rayos X muestra una determinación rápida y no invasiva de la ubicación exacta y la distribución de los tumores de mieloma múltiple dentro del esqueleto del ratón. La bioluminiscencia producida por estas células tumorales injertadas se puede medir en serie y de forma no invasiva para evaluar los cambios en el crecimiento tumoral. Además, se puede controlar la supervivencia de los ratones tratados con el inhibidor de mTOR Temsirolimus y se pueden utilizar pruebas de emisión de positrones y análisis de tomografía computarizada para la captación de fludexiglucosa radiomarcada por tumor para demostrar cambios mediados por Temsirolimus en el metabolismo de la glucosa.Al realizar este procedimiento es importante inyectar las células IEV. Hemos descubierto que si no se inyectan las células en la vena se produce la formación de células tumorales no injertadas en la médula cerca del lugar de la inyección. Después de este procedimiento, otros métodos como la inmunohistoquímica y la micro-CT se pueden utilizar para abordar preguntas sobre el impacto de los tumores en la arquitectura ósea y los componentes celulares y moleculares no tumorales del entorno de la médula.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Condicional Knockdown de genes en líneas celulares de cáncer para estudiar el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del Tumor

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

General protocolo muestra y médula de proceso para medir enfermedad Residual medible y células leucémicas en la leucemia mieloide aguda

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

Efectos duales de factores derivados de células de Melanoma en la diferenciación de adipocitos de médula ósea

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Tomografía Molecular de la fluorescencia para obtener imágenes In Vivo de xenoinjertos de Glioblastoma

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Repression of Multiple Myeloma Cell Growth In Vivo by Single-wall Carbon Nanotube (SWCNT)-delivered MALAT1 Antisense Oligos

Repression of Multiple Myeloma Cell Growth In Vivo by Single-wall Carbon Nanotube SWCNT-delivered MALAT1 Antisense Oligos

Represión del crecimiento de la célula del mieloma múltiple en Vivo de nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT)-entregado Oligos antisentido MALAT1

The single-wall carbon nanotube (SWCNT) is a new type of nanoparticle, which has been used to deliver multiple kinds of drugs into cells, such as ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establecimiento y Análisis de Organoides Tridimensionales (3D) Derivados de los Especímenes de Metastasis ósea del Cáncer de Próstata del Paciente y sus Xenoinjertos

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Imágenes dinámicas de células T receptoras de antígeno quimérico con [18F]Tomografía por emisión de positrones tetrafluoroborato/Tomografía computarizada

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Detección simultánea basada en imágenes y citometría de flujo de múltiples marcadores de senescencia fluorescente en células cancerosas senescentes inducidas por terapia

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...