Name: identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

这项议定书是利用在雪松-西奈医学中心的理事会再生医学研究所 (HSG) 的资金, 在美国位免疫学家协会 (HSG) 的免疫学奖学金的职业生涯, 以及学者奖美国血液学学会 (哎)。我们感谢雪松-西奈医疗中心的流式细胞术核心, 以协助进行外地分类。

这里描述的所有方法都是由雪松-西奈医疗中心的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的。
1. 小鼠骨髓的分离和单细胞悬浮液的制备
<ol><li>按照机构指南弄死鼠标。</li>
	<li>将安乐死的老鼠放在背部, 用70% 乙醇 (乙醇) 喷洒。用锋利的尖剪刀在脚踝的每个后肢上做一个小 (3-5 毫米) 切口, 然后将皮肤拉向身体, 从腿部取出, 露出肌肉和骨骼。</li>
	<li>从骨骼中取出肌肉 (四头肌, ...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production.">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1++CD115++CD135++common+macrophage/DC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation.">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li><li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor.">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes.">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li><li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice.">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil,+monocyte,+and+dendritic+cell+production.">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li></ol>

小鼠髓质祖细胞魏斯曼门策略1已经是位免疫学家和 hematologists 的黄金标准近20年, 但现在明显的是, "CMP" 和 "GMP" 门是非常异构和更精确需要浇口策略。我们在这里描述的协议允许在 C57BL/6J 小鼠中识别 oligopotent 和沿袭所承诺的子集, 以便更精确地定量化特定的髓样祖细胞和 myelopoiesis 通路的映射, 以及调查在髓系分化的特定阶段运作的分子机制。祖子集可以被排序, 如果需要的话, ?...

单核细胞, 中性粒细胞和树突状干细胞 (DCs) 是由造血祖, 主要是在骨髓中, 由一个称为 myelopoiesis 的过程中产生的髓体细胞。常见的髓样祖细胞 (中医) 有可能产生髓体细胞, 以及巨和红细胞, 而不是淋巴细胞。粒细胞-单核细胞祖 (GMPs) 是由中医衍生而成的, 其产生的是颗粒和单核细胞, 但失去了巨和红细胞电位。单核细胞和经典和浆 DCs (招揽/pDCs) 也被认为是由一般的祖细胞-DC 祖 (mdp 以) 产生的, 这是由中医生产的. 世系势的逐步限制最终导致沿袭前身: 粒细胞祖, 单核细胞祖, 树突状体细胞祖 (图 1)。
魏斯曼和同事报告说, 中医是在林 c-试剂盒+ Sca-1- (LKS) CD34+ FcγR 的小鼠骨髓部分, 而 GMPs 包含在 LKS CD34 + FcγR嗨分数1。然而, 这些 "CMP" 和 "GMP" 分数是非常异构的。例如, "GMP" 分数也包含血统承诺粒细胞祖和单核细胞祖1,2。mdp 以分别被报告为 CX3CR1+ Flt3+ CD115+祖细胞也表达 CD34 和 FcγR3,4。mdp 以产生了 cDC/pDC 产生的共同 DC 祖 (CDPs), 据报道, 它表示较低水平的 c 套件 (CD117), 并没有包括在 LKS 分数5.
以前假定单核细胞是通过单一途径产生的 (CMP-GMP-MDP 单核细胞)。与这个模型相一致的是, 由 GMPs (命名的单核细胞祖, MPs)2和 mdp 以 (命名的共同单核细胞祖, cMoPs) 产生的单核细胞的祖细胞,6在共享表面标记表达式的基础上似乎是同一单元格.然而, 我们最近证明单核细胞是由 GMPs 和 mdp 以独立产生的, 并且能够通过单细胞 RNA 测序7区分 MPs 和 cMoPs。
我们最近修改了魏斯曼 "CMP" 和 "GMP" 浇口战略, 以确定6脂蛋白亚组分的 C57BL/6J 小鼠骨髓含有不同的 oligopotent 和血统承诺髓祖亚群。我们首次报告说, Ly6C 和 CD115 染色允许隔离 oligopotent GMPs, 以及粒细胞祖 (GPs) 和单核细胞祖 (我们目前无法分离的 MPs 和 cMoPs) 从 "GMP" 分数2 (LKS-CD34+ FcγRhi门;图 1)。我们随后证明, mdp 以主要见于 "CMP" 分数 (LKS- CD34+ FcγRlo门), 其中还包含 Flt3+ CD115lo和 Flt3-子集7 (图1).CMP-Flt3+ CD115 的 GMPs 和 mdp 以在收养转移时产生。CMP-Flt3 子集包含的祖细胞似乎是中间体之间的 CMP-Flt3+ CD115 和 GMPs。与 mdp 以不同, CMP-Flt3+ CD115 和 CMP-Flt3 分数也具有巨和红细胞电位。
然而, 必须指出的是, 目前尚不清楚 "CMP" 分数是否包含真正 oligopotent 的祖细胞 (例如, CMP-Flt3+ CD115 中的单个单元, 它拥有中性粒细胞,单核细胞、DC、巨和红细胞电位), 或二者择一地, 构成了一个具有更限制性血统潜能的祖先的混合物。菌落形成检测 (纤维素培养) 揭示了粒细胞 (中性粒细胞), 红细胞, 单核和巨电位 (GEMM 细胞) 在 "CMP", CMP-Flt3+ CD115lo和 CMP-Flt3-分数1 ,7、但不允许对直流电位进行评估。与此相反, 菌落形成检测表明, 在 "GMP" 分数1,2, oligopotent GMPs (祖细胞和单核细胞潜能) 的存在, 这是支持的最近单细胞transcriptomic 分析8。然而, 目前还不知道这些 oligopotent GMPs 是否也产生其他粒细胞 (嗜酸性粒、嗜碱性细胞和肥大的干细胞)。
在这些研究的基础上, 我们现在展示了7表面标记 (c 套件, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C 和 CD115) 可以用来识别和分离这6个子集的 oligopotent 和血统承诺的髓细胞祖细胞。这里描述的协议可以应用于体外培养试验 (纤维素或液体培养), 在小鼠体内移植实验, 分子分析 (块状和单细胞 RNA 测序, 西方印迹, 等)。
该协议由3个阶段组成: 1) 制备骨髓细胞单细胞悬浮液, 2) 对造血祖 (磁性活化细胞分选) 和 3) 进行富集鉴定, 并根据需要隔离祖子集, 通过流动细胞术 (根据需要使用分析仪或分拣机)。第一步是从安乐死小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓细胞, 类似于先前描述的9项协议。接下来, 通过对红细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等细胞表面标志物的抗体, 对茎和祖细胞进行浓缩, 以耗尽分化的细胞。这不是强制性的, 但强烈建议优化检测的祖子集, 并减少所需的抗体数量的祖鉴定和流式细胞术所需的时间。下面的沿袭损耗协议描述了磁活化细胞分类 (mac) 使用鼠标谱系细胞耗尽套件 (其中包含生物素化抗体对 CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 和 Ter-119, 外加抗生物素微珠) 和自动磁选机。最后一步是流式细胞术对祖子集的识别 (和排序, 如果需要的话)。下面描述的抗体面板 (另见表 1) 已设计用于流式细胞仪 (分析仪或分拣机) 与4激光器 (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> 图 1: 中性粒细胞、单核细胞、DC 祖和分化通路.最近修订的 myelopoiesis7模型被说明, 魏斯曼门为 "中医" (蓝色) 和 "GMPs" (绿色)1覆盖。这一数字已从亚涅斯等20177修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)</td>
			<td style="width:177px;">The Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:172px;">Cat#JAX:000664</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">Cat#130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#553733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD16/CD32 (Fc&#947;R; clone 93) APC-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#101327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#108114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#105820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#128012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#135506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#560718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:172px;">Cat#C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">AutoMACS Separator</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>Use the &#34;deplete&#34; program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 15 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD FACS Aria III cell sorter</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 13 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FlowJo</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:172px;">https://www.flowjo.com</td>
			<td>For further analysis of the .fcs files</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow

产生中性粒细胞、单核细胞和树突状干细胞 (DCs) 的髓祖原体可以在小鼠骨髓中发现并分离, 用于血液和免疫学分析。例如, 对髓祖种群的细胞和分子特性的研究可以揭示白血病转化的机制, 或者证明免疫系统对病原体暴露的反应。以前描述的流式细胞术策略, 为髓质祖鉴定已在许多领域取得了重大进展, 但他们确定的分数是非常异构的。最常用的浇口策略定义了为所需种群丰富的骨髓成分, 但也含有大量的 "污染" 祖细胞。我们最近的研究已经解决了这种异质性的大部分问题, 我们在这里提出的协议允许从2以前描述的骨髓分数中分离出6亚 oligopotent 和沿袭的髓样祖细胞。该协议描述了3个阶段: 1) 骨髓细胞的分离, 2) 通过磁活化细胞分选 (互连法) 对造血祖体细胞进行浓缩, 3) 流式细胞仪识别髓祖亚群 (包括荧光活化细胞分类, 如有需要, 则进行。这种方法允许祖细胞的数量和分离的各种体外和体内应用, 并已产生了新的洞察力的途径和机制的中性粒, 单核细胞和 DC 分化。

使用上述协议, 有可能获得1亿细胞 (包括红细胞, 或5000万有核细胞) 的股骨和胫骨 (2 条腿) 的一个 C57BL/6J 鼠 (6-8 周, 男性或女性)。1-200万林细胞可以被孤立的每只老鼠的林+细胞耗竭。
6髓系祖群中的每一个都构成了 1- 4% 的林细胞。血统耗尽是有效的消耗分化细胞和丰富的祖细胞, 但林分包含了很...

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Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

我们展示了如何用磁性和荧光分选 (mac 和流动力学) 相结合的方法, 从小鼠骨髓中识别和分离出6个髓样祖细胞。本协议可用于体外培养测定 (纤维素或液体培养),体内移植实验, RNA/蛋白质分析。

小鼠骨髓 Oligopotent 和世系髓样祖细胞的鉴定与分离

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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区分功能基因表达的作用，通过骨髓移植免疫和非免疫细胞在小鼠结肠炎

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

科研

免疫与感染

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

使用骨髓源性巨噬细胞巨噬细胞极化的调查

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

功能研究和过继转移实验小鼠骨髓嗜中性粒细胞的分离，纯化及贴标

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

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In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

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Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

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从老鼠皮肤及引流淋巴结髓细胞分离皮下继免疫减毒活<em&gt;疟原虫</em&gt;孢子

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代和GM-CSF的鉴定源性肺泡状巨噬细胞和树突状细胞从小鼠骨髓

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...