Name: a high-throughput, high-content, liquid-based c. elegans pathosystem
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מכון המחקר של טקסס (CPRIT) פרס RR150044, ולש קרן מחקר גרנט C-1930, ומניעת סרטן על ידי את נבחרת מוסדות של בריאות K22 AI110552 מוענק NVK. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.

התראה: aeruginosa פ ו א faecalis פתוגנים אבטחה ברמה 2, נאות אמצעי זהירות יש לנקוט כדי למנוע זיהום מקרי וכדי לצמצם את זיהום של משטחים. כל המדיה והחומרים אשר באים במגע עם פתוגנים חייב להיות מעוקר ו/או שנמחקו. הנחיות נוספות זמינות מהפרסום CDC אבטחה Microbiological, ביו מעבדות (BMBL), המהדורה החמישית.
<p clas...

<ol>
	<li>Falagas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandrug-resistant+Klebsiella+pneumoniae,+Pseudomonas+aeruginosa+and+Acinetobacter+baumannii+infections:+Characteristics+and+outcome+in+a+series+of+28+patients.">Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).</li><li>Hsueh, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+causing+nosocomial+infections+in+a+university+hospital,+Taiwan.">Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).</li><li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+among+hospitalised+patients:+clinical+features,+risk-factors+and+outcomes.">Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes.</a> Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Draft+genome+sequences+of+pandrug-resistant+Serratia+marcescens+clinical+isolates+harboring+blaNDM-1.">Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1.</a> Genome Announcements. 5 (3), (2017).</li><li>Utari, P. D., Quax, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+reveals+novel+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+mechanism.">Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism.</a> Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).</li><li>Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+novel+anti-infectives+using+a+C.+elegans+pathogenesis+model.">High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).</li><li>Kirienko, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+disrupts+Caenorhabditis+elegans+iron+homeostasis,+causing+a+hypoxic+response+and+death.">Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death.</a> Cell Host &amp; Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).</li><li>Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content,+phenotypic+screen+identifies+fluorouridine+as+an+inhibitor+of+pyoverdine+biosynthesis+and+pseudomonas+aeruginosa+virulence.">A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence.</a> mSphere. 1 (4), (2016).</li><li>Manning, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+content+microscopy+assay+to+determine+drug+activity+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis.">A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis.</a> Methods. 127, 3-11 (2017).</li><li>Marwaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylated+derivatives+of+sulfamethoxazole+and+sulfafurazole+inhibit+intracellular+growth+of+Chlamydia+trachomatis.">N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).</li><li>Kota, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+high-content+imaging+and+chemical+genetics+to+probe+host+cellular+pathways+critical+for+Yersinia+pestis+infection.">Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection.</a> PLoS One. 8 (1), e55167 (2013).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cell+infection+caused+by+Listeria+monocytogenes+invasion.">Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion.</a> Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).</li><li>Jayamani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Francisella+tularensis-Caenorhabditis+elegans+pathosystem+for+the+evaluation+of+therapeutic+compounds.">Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).</li><li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model.">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).</li><li>Rajamuthiah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+automated+platform+for+drug+discovery+against+multi-drug+resistant+Staphylococcus+aureus.">Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus.</a> PLoS One. 9 (2), e89189 (2014).</li><li>Breger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+chemical+compounds+identified+using+a+C.+elegans+pathogenicity+assay.">Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), e18 (2007).</li><li>Garvis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+semi-automated+liquid+screen+reveals+a+specialized+role+for+the+chemotaxis+gene+cheB2+in+Pseudomonas+aeruginosa+virulence.">Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540 (2009).</li><li>Zhou, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+novel+screening+model+for+assessing+the+bioactivity+of+extracts+against+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+using+Caenorhabditis+elegans.">An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visual Experiments. (51), (2011).</li><li>Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+confers+resistance+to+siderophore-mediated+killing+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).</li><li>Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+PA14+pathogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).</li><li>Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine,+a+siderophore+from+Pseudomonas+aeruginosa,+translocates+into+C.+elegans,+removes+iron,+and+activates+a+distinct+host+response.">Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response.</a> Virulence. , 1-41 (2018).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans.">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li><li>Tjahjono, E., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+mitochondrial+surveillance+pathway+is+required+for+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa.">A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genetics. 13 (6), e1006876 (2017).</li><li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model.">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).</li><li>Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-16+protects+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+during+food+deprivation.">daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation.</a> The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).</li><li>Beanan, M. J., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+germ-line+proliferation+mutation+in+C.+elegans.">Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans.</a> Development. 116 (3), 755-766 (1992).</li></ol>

זה assay (או מבחני דומה שבו פתוגנים אחרים המוחלפים aeruginosa פ או faecalis א) שימושי למגוון רחב של מטרות, לרבות גילוי תרופות. זה שימושי גם למיעון שאלות הביולוגיים הבסיסיים, כגון בזיהוי הגורמים התקפה אלימה, הבהרה של המארח ההגנה מסלולים, וקביעת את הרגולציה והמיכון באינטראקציה פתוגן-פונדקאי....

בזיהוי ופיתוח של אפקטיביות, ותתנו לו אנטיביוטיקה, עכשיו כמעט לפני מאה שנה, הוביל רגע של התעוררות בתחום בריאות הציבור איפה שהיתה אמונה פרושות לרווחה כך זיהומיות מחלות יהיה יסורים של העבר. בתוך כמה עשורים קצר, האופטימיות הזו החלה לדעוך, כמו הפתוגן לאחר הפתוגן פיתחו מנגנוני ההתנגדות המוגבלת הטיפולים פעם מופלא. כבר כמה זמן, מרוץ החימוש בין במאמצי הגילוי סמים פתוגנים נראה מאוזן. עם זאת, ניצול לרעה של antimicrobials שהגיע לשיא לאחרונה לצמיחתה של זנים עמידים בפני פאן-התרופה של pneumoniae קלבסיאלה, Acinetobacter baumanii, בסרישיה marcescensו פ aeruginosa1, 3, 2,4.
Aeruginosa פ הוא הזדמנותית, גראם שלילי, מרובה מארחים הפתוגן שמהווה איום חמור לחולים עם כוויות חמורות, מי immunocompromised, או בעלי סיסטיק פיברוזיס. הוא גם יותר ויותר מזוהה בתור סוכן סיבתי זיהומים nosocomial חמורה, במיוחד בשל רכישתה מתמשך של עמידות מיקרוביאלית. כדי להתחיל לתת מענה לאיום הזה, השתמשנו את מתועדת היטב C. elegans-aeruginosa פ זיהום מערכת5. המעבדה שלנו יש ממונף מערכת זו לפתח פלטפורמה ההקרנה בנוזל, תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן כדי לזהות תרכובות הרומן להגביל את יכולתם של המחלה להרוג את המארח6. מסקרן, תרכובות אלו נראה שייך לפחות לשלוש קטגוריות כלליות, כולל antimicrobials7 והתקפה אלימה מעכבי8. אחרים מבחני גילוי סמים גבוהה-תוכן C . elegans דווחו Mycobacterium tuberculosum, כלמידיה trachomatis, Yersinia pestis, ליסטריה, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, קנדידה אלביקנס, ו Enterococcus faecalis, בין היתר9,10,11,12,13,14,15,16. סוגים אלה של מבחני יש מספר יתרונות מוכרת היטב, כגון הגבלת כניסות חיובי כוזב עלולים להיות רעילים הן המארח הפתוגן, גדל הסיכוי הזמינות הביולוגית לעומת מסך כימי, ואת היכולת לזהות את הלהיטים מעבר פשוט הגבלת צמיחת חיידקים, כגון אנטי-virulents, מערכת החיסון מולקולות מופחתים או תרכובות אחרת להטות את האיזון של אינטראקציה פתוגן-פונדקאי לטובת לשעבר. בנוסף, תרכובות גילה במסכים אלה הם לעתים קרובות יעיל בתרבית של המארחים.
ראוי לציין כי לפחות שני אחרים מבחני17,18 זמינים לביצוע בתפוקה גבוהה מסכי C . elegans בנוזל. עם זאת, כל אלה מבחני הוא שינוי המאפשר וזמינותו מעיים-קולוניזציה הטיפוסי, המכונה לאט-הרג, שיש לבצע בנוזל, הגדלת התפוקה ומאפשר תרכובות שיוקרנו בקלות רבה יותר. אפיון זהיר הוכיחה באופן סופי כי המנגנון של התקפה אלימה חיידקי הם שונים בין אלה מבחני שלנו בנוזל מסך7. מאז שני סוגי התקפה אלימה הם נצפו מערכות יונקים, חשוב לקחת בחשבון אילו דטרמיננטה התקפה אלימה רלוונטי ביותר עבור האינטרסים של הנסיין לפני בחירה וזמינותו.
כאן אנחנו מדגימים גירסה אופטימיזציה של בנוזל assay aeruginosa elegans-עמ' ג . אנחנו גם לדווח על ההסתגלות בשיטה assay בנוזל שלנו כדי להכיל את פתוגן חיידקי גראם חיוביים Enterococcus faecalis. כמו aeruginosa פ, א faecalis יותר ויותר מזוהה איום רציני nosocomial עם חימוש הגוברת של עמידות מיקרוביאלית מסלולים1. למרות שיטה קודמת להקרנה תפוקה גבוהה של אי faecalis קיים14, זה דורש preinfection עם המחלה, אשר מסבך את ההליך, מגבירה את הסבירות של מזהם ציוד כמו FlowSort COPAS. פרוטוקול שלנו מבטלת את הצורך לפני הפגיעה, לשפר את פרופיל הבטיחות. לבסוף, אנו מדווחים על אמצעי שבאמצעותו משני מבחני אלה יכול להיות משולב עם האכלה RNAi, המאפשר למשתמש לחפש גורמים מארח לשחק תפקיד בהקמת, או התנגדות, זיהום.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>COPAS FP BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td>Large object flow cytometer/worm sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EL406 Washer Dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Deep-Well RB Block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CS15124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>MPG-781091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Media (NGM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow Killing (SK) plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow Killing (SK) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter:&#160; 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>L1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brian Heart Infusion broth (BHI)</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>50-488-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Bleach Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S Basal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>S5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>P3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>P5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Sodium Hypochlorite Solution</td>
			<td>BICCA</td>
			<td>7495.5-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P. aeruginosa (PA14)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. faecalis(OG1RF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli superfood (OP50)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Strains </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput, high-content, liquid-based c. elegans pathosystem

מספר תרופות חדשות שזוהו על ידי מסורתית, מסכי במבחנה נחלשה, הפחתת ההצלחה של גישה זו בחיפוש אחר נשק חדש למאבק רב תרופתיים. זה הוביל למסקנה כי החוקרים אינם רק צורך למצוא תרופות חדשות, אבל גם צריך לפתח דרכים חדשות למצוא אותם. בין המועמד המבטיח ביותר שיטות הן כל-אורגניזם, ויוו assays המפרט את השימוש תפוקה גבוהה, פנוטיפי ומארח שנעים בטווח שבין Caenorhabditis elegans ל רזבורה rerio. מארחים אלה יש מספר יתרונות רב עוצמה, כולל הפחתה דרמטית כניסות חיובי כוזב, שחרורן תרכובות רעילים המארח ו/או biounavailable הם בדרך כלל במסך הראשוני, לפני בצע יקר למעלה.
הנה אנחנו מראים כיצד נעשה שימוש assay שלנו לחקור מארח את הוריאציה מתועדת היטב C. elegans—Pseudomonas aeruginosa הרג נוזלי pathosystem. אנחנו גם להוכיח מספר הרחבות של טכניקה זו הסתדר היטב. לדוגמה, אנו מסוגלים לבצע את מסכי גנטי תפוקה גבוהה באמצעות RNAi ב 24 - או 96-ובכן צלחת תבניות לגורמים מארח שאילתה באינטראקציה זה פתוגן-פונדקאי. שימוש assay הזה, מסכי הגנום כולו ניתן להשלים רק כמה חודשים, אשר יכול באופן דרמטי לפשט את המשימה של זיהוי מטרות סמים, שעשוי להיות ללא צורך גישות טיהור הביוכימי מפרך.
אנחנו גם מדווחים כאן וריאציה של השיטה שלנו, שמחליפה את חיידק גראם חיוביים Enterococcus faecalis עבור המחלה גראם שליליים aeruginosa פ. כמו כן עבור aeruginosa פ, הרג מאת faecalis אי הוא תלוי-זמן. בניגוד הקודם C. elegans– מבחניאי faecalis , וזמינותו שלנו עבור faecalis אי לא דורשת preinfection, שיפור פרופיל הבטיחות שלה והפחתת הסיכוי לזיהום ציוד למיון נוזלי. וזמינותו היא חזקה מאוד, מציג ~ 95% שיעורי המוות 96 h פוסט זיהום.

פרמטרים חשובים לביצועים assay
הבנה נכונה של הביולוגיה שבבסיס assay הזה הוא הכרחי עבור פתרון בעיות ומיטוב וזמינותו. לשם כך, אנו מתייחסים קודם בכמה עיתונים מרכזיים שחקרתי על מנגנוני פתוגנזה של פ aeruginosa-מתווכת הורג נוזלי7<sup...

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem at JoVE.com

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

כאן נתאר פרוטוקול הוא מתאקלם מהר, כל מחשב מארח, כלי סינון גבוהה-תוכן יכול להיות מנוצל כדי ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי ולשמש לצורך גילוי תרופות.

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

גילוי תרופות בהנחיית: Assay אוטומטי גבוהים תוכן דלקת דג הזברה

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

הפרדה אוטומטית של<em&gt; ג elegans</em&gt; יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ<em&gt; Enterica סלמונלה</em&gt; Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

אוטומטיות התנהגותית ניתוח של גדול C. elegans אוכלוסיות שימוש רחב שדה-of-view מעקב פלטפורמה

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...