Name: a high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of hiv-1 viral membrane fusion
Uploaded: 2018-08-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH/NIAID AI112423 e NIH/NIGMS GM113885 a Benjamin K. Chen e NIH/NIAID K08-AI120806 a Talia H. Swartz. Vorremmo ringraziare la scuola di medicina di Icahn al Mount Sinai Dean di flusso Cytometry CORE.

1. generazione di linee di cellule bersaglio
Nota: Questo passaggio è facoltativo; Se si utilizza una linea di cella di destinazione RG esistente, iniziare dal passaggio 2.
<ol><li>Cotransfect un piatto di confluenti 10 cm 70% di 293T cellule11 [in 10 mL di medium dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS)] con pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE10 e pCL-10A112 (plasmide imballaggio) in...

<ol>
	<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+identifies+pharmacological+inhibitors+of+HIV+entry.">A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry.</a> Virology. 490, 6-16 (2016).</li><li>Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+enzyme-based+assay+detecting+HIV-1+virion+fusion+in+primary+T+lymphocytes.">A sensitive and specific enzyme-based assay detecting HIV-1 virion fusion in primary T lymphocytes.</a> Nature Biotechnology. 20, 1151-1154 (2002).</li><li>Huerta, L., Lamoyi, E., Baez-Saldana, A., Larralde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+envelope-dependent+cell-cell+fusion:+a+quantitative+fluorescence+cytometric+assay.">Human immunodeficiency virus envelope-dependent cell-cell fusion: a quantitative fluorescence cytometric assay.</a> Cytometry. 47, 100-106 (2002).</li><li>Sakamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+HIV+cell-cell+fusion+assay+by+using+two+genetically+modified+HeLa+cell+lines+and+reporter+gene.">Establishment of an HIV cell-cell fusion assay by using two genetically modified HeLa cell lines and reporter gene.</a> Journal of Virological Methods. 114, 159-166 (2003).</li><li>Herschhorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+cell-cell+fusion+system+with+integrated+ability+to+measure+the+efficiency+and+specificity+of+HIV-1+entry+inhibitors.">An inducible cell-cell fusion system with integrated ability to measure the efficiency and specificity of HIV-1 entry inhibitors.</a> PLoS One. 6, e26731 (2011).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88, 11504-11515 (2014).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+HIV-Cell+Fusion+Assay+for+Discovery+of+Virus+Entry+Inhibitors.">High-Throughput HIV-Cell Fusion Assay for Discovery of Virus Entry Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13, 155-166 (2015).</li><li>Giroud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Functional+Profiling+of+Small-Molecule+HIV-1+Entry+and+Fusion+Inhibitors.">Screening and Functional Profiling of Small-Molecule HIV-1 Entry and Fusion Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 15, 53-63 (2017).</li><li>Hubner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> Journal of Virology. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9, 81-83 (2011).</li><li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+Rapid+production+of+helper-free,+high+titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Phosphate+Transfection.">Calcium Phosphate Transfection.</a> Current Protocols in Immunology. 10, 10-13 (2001).</li></ol>

Il dosaggio di Gag-iCre ha dimostrato di essere molto utile per lo screening di farmaci candidati che possono inibire il passaggio di fusione della replicazione virale. Quando si esegue questo test, i passi più importanti per ottenere un buon segnale sono simili a più virale infezione saggi. Il primo passaggio fondamentale è produrre alti titoli del virus di buona qualità. Questo passaggio richiede che le cellule 293T sono attraversate frequentemente (almeno 1 x ogni 48 h) così non diventano overconfluent e raggrupp...

La necessità di terapie antiretrovirali romanzo ha richiesto lo sviluppo di schermi ad alta produttività per gli inibitori di HIV-1 entrata. L'analisi del reporter di Gag-iCre è stato sviluppato per identificare inibitori dell'entrata virale nella fase di fusione in un sistema di infezione della cellula--cellula misurando in particolare fusione della membrana virale con la membrana cellulare di host1. Un'analisi è stata sviluppata alla schermata per nuovi inibitori che ha agito in particolare nelle fasi iniziali dell'infezione da HIV-1 fino al punto di fusione della membrana virale. Una sfida per l'infezione della cellula-cellula di misurazione è che l'inoculo iniziale contiene le cellule erogarici infetti e cellule bersaglio ininfected, quindi nuova infezione di misura è difficile discriminare dalle celle di input. Il sistema ideale comporterebbe un gene eterologo marcatore che può essere indotta dall'avvio di un'infezione di cella di destinazione e non è presente nella cellula donatrice. Un contenuto virale popolare saggio basato su una fusione di proteina-enzima virale, BlaM-Vpr, di miscelazione può essere efficace, ma ha limitazioni per throughput elevato, cella selezione2. Questo test comporta un gene del reporter beta-lattamasi (BlaM) che è fusa a HIV-1 Vpr, confezionato in virioni e consegnato nelle celle di destinazione al momento della fusione della membrana virale. Il substrato CCF2-AM viene caricato nel citoplasma delle cellule bersaglio e subisce un cambiamento di fluorescenza su fenditura. Il substrato di CCF2-AM è costoso e può essere proibitivo per gli schermi ad alta velocità. Al fine di distinguere le cellule del donatore e di destinazione, è necessario tintura ecologica delle popolazioni. Infine, il protocollo richiede diversi passaggi di lavaggio e incubazione che possono essere gravoso e costoso quando si verifica un numero elevato di composti.
Il dosaggio di Gag-iCre è stato sviluppato come una soluzione a questi problemi, per sviluppare un high throughput screening per gli inibitori della fusione nella trasmissione della cellula--cellula. Questo sistema non richiede il substrato deve essere caricato nelle celle. Il metodo può essere utilizzato anche per gli studi senza cellula ed è adattabile ad altri studi di fusione virale usando le particelle del virus HIV-1 Gag-iCre pseudo-tipizzate. Saggi di fusione HIV Env mediata cellula-cellula possono misurare la fusione di virus Env proteina-mediata delle cellule, tuttavia questi non usano particelle di virus reale come il test di HIV-1 Gag-iCre3,4,5. Questo test può essere letto con microscopia di flusso cytometry o fluorescenza. Esso è stato utilizzato con successo a schermo la libreria di FDA, nonché una piccola biblioteca di purinergic inibitori1,6. Altri ricercatori hanno anche identificato purinergic inibitori in HIV-1 fusione usando un'analisi di fusione di alto-rendimento adattato e ottimizzato che segnala il trasferimento di virus-incapsulato beta-lactamase nel citoplasma7,8 .
Il virus di Gag-iCre è stato progettato con un approccio simile al virus Gag-iGFP, inserimento di Cre ricombinasi tra matrice e capside, affiancato da HIV-1 proteasi siti9. L'enzima Cre è fatto come un precursore inserito all'interno della poliproteina Gag che matura quando proteasi HIV-1 sono attivato entro la particella virale nascente. La consegna di Cre dipende, quindi, la consegna del contenuto di una particella di HIV-1 proteasi-attivati in un bersaglio cellulare tramite un processo di fusione della membrana virale. Qui sono disponibili due versioni del protocollo. Il primo utilizza una popolazione di infezione da HIV-1 per infettare le cellule bersaglio, per studiare la trasmissione diretta di cellula--cellula dell'HIV. La seconda versione utilizza un virus senza cellula per studiare un'infezione virale senza cellula. Analisi della cellula--cellula trasmissione prende 7 giorni per essere completato dal giorno che le cellule vengono scongelate, o 5 giorni se le cellule sono già scongelate e attraversate. Il dosaggio di infezione senza cellula può essere effettuato in 5 giorni se le cellule devono essere scongelati e 3 giorni, se le cellule sono scongelate e attraversate. Vengono inoltre fornite istruzioni per generare una linea cellulare di destinazione (da rosso a verde) RG nel tipo di cella desiderata (se non viene utilizzata una preesistente linea cellulare di destinazione RG) utilizzando un plasmide creato dal Clevers Lab10. È consigliabile che biosicurezza adeguate precauzioni sono prese con il virus e le cellule che esprimono virus in questa analisi. Conduciamo la porzione infettiva di questo test in una struttura di coltura del tessuto BSL2 +. Dopo che le cellule sono fissi, essi possono essere analizzati in strutture di microscopia e citometria a flusso standard.
Qui descriviamo l'applicazione di questo test a schermo per romanzo composti che inibiscono la fusione della membrana virale di HIV-1 (Figura 1). Recettori purinergici sono mediatori pro-infiammatori. Il nostro laboratorio ha dimostrato che gli inibitori non selettivi dei recettori purinergici agiscono come inibitori di HIV-1 membrana virale vmware fusion6. Segnaliamo che l'utilizzo di questo test in alta velocità effettiva può identificare romanzo inibitori di fusione della membrana virale di HIV-1. Dimostriamo che un inibitore della classe di recettori purinergici rappresenta una nuova classe di inibitori di fusione della membrana virale di HIV-1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5546</td>
			<td>Media for 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R0883</td>
			<td>Media for Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140-071</td>
			<td>Serum for 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Serum for Jurkat Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Penn/Strep used in both media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td>Used for Culture of Jurkat Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm Tissue Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>Used for Culture of 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Plates (tissue culture Treated)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>Used for fusion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyjet Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>Used to transfect 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-100ML</td>
			<td>Used in wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Trypsin Protease</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>For Trypsinization of 293 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VACA-1003</td>
			<td>For Nucleofection of Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque plus</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>17144002</td>
			<td>For Nucleofection of Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>For all tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P3020-CPS</td>
			<td>For all tissue culture and liquid handling steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter (0.45 micron)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHA033</td>
			<td>For filtration of virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile syringes</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>309656</td>
			<td>For filtration of virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>2b</td>
			<td>for Nucleofection of Jurkats (various models available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>for flow cytometry analyss of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td>Fortessa 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>32702</td>
			<td>Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCL10a1</td>
			<td>Novus Bio</td>
			<td>NBP2-29542</td>
			<td>Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag-iCre</td>
			<td>Benjamin Chen Lab</td>
			<td></td>
			<td>Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of hiv-1 viral membrane fusion

Questo test è progettato per segnalare in particolare il HIV-1 fusione tramite l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) rilevabile da microscopia di flusso cytometry o fluorescenza. Un virus di reporter di HIV-1 (HIV-1 Gag-iCre) viene generato inserendo il genoma di HIV-1 tra la matrice e le proteine del capside della poliproteina Gag Cre ricombinasi. Ciò si traduce in un packaging di Cre ricombinasi in particelle di virus, che viene poi rilasciato in una cella di destinazione linea che esprimono stabilmente un Cre ricombinasi-rosso fluorescente proteica attivata (RFP) Cassetta di interruttore GFP. Nello stato basale, questa cassetta esprime solo RFP. Dopo la consegna di Cre ricombinasi nella cella di destinazione, la RFP, affiancata da siti loxP, accise, con conseguente espressione di GFP. Questo test può essere utilizzato per verificare eventuali inibitori dell'entrata virale (in particolare presso il passo di fusione) in sistemi di infezione senza cellula e cellula--cellula ed è stato utilizzato per identificare una classe degli antagonisti del recettore purinergico come nuovi inibitori della fusione della membrana virale di HIV-1.

Le cellule di Jurkat RG non infetti presentano un basso livello di segnale di fondo GFP (0,3%) con un segnale molto forte di RFP (Figura 2A, colonna non infetto). L'infezione con Gag-iCre provoca un aumento nel segnale GFP (24,9%,) mentre la presenza di inibitore di fusione di HIV-1 AMD3100 (20 µM) inibisce lo sviluppo di questo segnale, portandola a livelli di sfondo non infetti (0,34%). Quando un inibitore di un evento post-fusione come l'inibitore di tras...

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A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Descriviamo un'analisi basata sulle celle per segnalare il HIV-1 fusione tramite l'espressione della proteina fluorescente verde rilevabile da microscopia di flusso cytometry o fluorescenza. Può essere utilizzato per testare gli inibitori dell'entrata virale (in particolare presso il passo di fusione) in sistemi di infezione senza cellula e cellula--cellula.

Un High-throughput Cre-Lox attivato membrana virale Fusion test per identificare gli inibitori di fusione della membrana virale di HIV-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

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