Name: a high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of hiv-1 viral membrane fusion
Uploaded: 2018-08-14T14:00:00
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この研究は、NIH/NIAID AI112423 とベンジャミン ・ k ・陳に NIH/日の出 GM113885、タリア h. シュワルツに NIH/NIAID K08 AI120806 の補助金によって支えられました。マウント シナイ ディーン流れ Cytometry コアで、Icahn 医学部に感謝したいと思います。

1. ターゲット細胞の生成
注: この手順は省略可能です。既存の RG ターゲットのセルラインを使用している場合は、手順 2 で開始します。
<ol><li>293 t 細胞11 [ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) を 10 mL]10 pCL 10A1 の pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE で12 (包装プラスミド) の 70% コンフルエント 10 cm プレート?...

<ol>
	<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+identifies+pharmacological+inhibitors+of+HIV+entry.">A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry.</a> Virology. 490, 6-16 (2016).</li><li>Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+enzyme-based+assay+detecting+HIV-1+virion+fusion+in+primary+T+lymphocytes.">A sensitive and specific enzyme-based assay detecting HIV-1 virion fusion in primary T lymphocytes.</a> Nature Biotechnology. 20, 1151-1154 (2002).</li><li>Huerta, L., Lamoyi, E., Baez-Saldana, A., Larralde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+envelope-dependent+cell-cell+fusion:+a+quantitative+fluorescence+cytometric+assay.">Human immunodeficiency virus envelope-dependent cell-cell fusion: a quantitative fluorescence cytometric assay.</a> Cytometry. 47, 100-106 (2002).</li><li>Sakamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+HIV+cell-cell+fusion+assay+by+using+two+genetically+modified+HeLa+cell+lines+and+reporter+gene.">Establishment of an HIV cell-cell fusion assay by using two genetically modified HeLa cell lines and reporter gene.</a> Journal of Virological Methods. 114, 159-166 (2003).</li><li>Herschhorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+cell-cell+fusion+system+with+integrated+ability+to+measure+the+efficiency+and+specificity+of+HIV-1+entry+inhibitors.">An inducible cell-cell fusion system with integrated ability to measure the efficiency and specificity of HIV-1 entry inhibitors.</a> PLoS One. 6, e26731 (2011).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88, 11504-11515 (2014).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+HIV-Cell+Fusion+Assay+for+Discovery+of+Virus+Entry+Inhibitors.">High-Throughput HIV-Cell Fusion Assay for Discovery of Virus Entry Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13, 155-166 (2015).</li><li>Giroud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Functional+Profiling+of+Small-Molecule+HIV-1+Entry+and+Fusion+Inhibitors.">Screening and Functional Profiling of Small-Molecule HIV-1 Entry and Fusion Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 15, 53-63 (2017).</li><li>Hubner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> Journal of Virology. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9, 81-83 (2011).</li><li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+Rapid+production+of+helper-free,+high+titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Phosphate+Transfection.">Calcium Phosphate Transfection.</a> Current Protocols in Immunology. 10, 10-13 (2001).</li></ol>

ギャグ本院アッセイはウイルス複製の融合段階を阻害することが薬剤の候補者をスクリーニングするため非常に有用であると証明しました。この分析を実行すると、良好な信号を取得する最も重要なステップは、ほとんどのウイルス感染の試金に似ています。最初の重要なステップは、品質の良いウイルスの高価を作り出しています。この手順は、293 t 細胞が必要です継代頻度 (少なくとも?...

新規抗レトロ ウイルス療法の必要性 hiv-1 侵入阻害剤の高スループット スクリーンの開発を求めています。ギャグ本院レポーターの試金はホスト細胞膜1ウイルス膜融合を具体的に測定することにより細胞に感染システムの融合の段階でウイルス エントリの阻害剤を識別するために開発されています。アッセイを開発したウイルス膜融合の時点までの HIV-1 感染症の初期の段階で具体的に行動した新規阻害剤のスクリーニング。感染細胞を測定する課題の 1 つですので、新しい感染の測定は入力セルから区別することは困難に、初期接種が感染ドナー細胞と ininfected ターゲット細胞に含まれています。理想的なシステムは、ドナー細胞の存在しないターゲット細胞感染症の開始によって誘導されうる異種の遺伝子マーカーを伴うでしょう。ウイルス蛋白質酵素融合、BlaM Vpr によるアッセイを混合人気バイラル コンテンツは、効果的、細胞スクリーニング2高スループットの制限があります。このアッセイには、β-ラクタマーゼ (バーン) レポーターの遺伝子で HIV 1 Vpr を融合、粒子にパッケージ化され、ウイルスの膜融合に標的細胞に配信が含まれます。基板 CCF2 AM は標的細胞の細胞質に読み込まれ、胸の谷間に蛍光シフトを受けます。CCF2 AM 基板は高価な法外な高スループット画面のためすることができます。ドナーとターゲットの細胞を区別するために色素ラベルする必要がある対象とする集団。最後に、プロトコルには、負担と高価なことができる多数の化合物をテストするとき、洗って、インキュベーションのいくつかの手順が必要です。
ギャグ本院アッセイは、高スループットの融合細胞間伝達の阻害剤のスクリーニングを開発する、これらの問題への解決策として開発されました。このシステムには、セルに読み込まれる基板は不要です。アッセイ無細胞研究も使えます、擬似型の HIV-1 ギャグ-本院ウイルス粒子を用いた他のウイルス融合研究に適応可能です。HIV Env を介した細胞融合アッセイは、しかし、これらは HIV 1 ギャグ-本院アッセイは3,4、5実際ウイルス粒子を使用しないでくださいウイルス Env 蛋白質による細胞融合を測定できます。この試金は流れの cytometry または蛍光顕微鏡で読むことができます。それは、正常にプリン阻害剤1,6の小さな図書館と同様に FDA ライブラリ画面に使用されています。他の研究者は、プリンを細胞質7,8ウイルス カプセル化 β-ラクタマーゼの転送を報告する適応し、最適化された高スループットの融合アッセイを用いた HIV 1 融合阻害剤を識別したも.
ギャグ本院ウイルスは、行列と HIV 1 プロテアーゼ サイト9が並ぶキャプシドの Cre リコンビナーゼを挿入するギャグ iGFP ウイルスに似たようなアプローチで設計されました。Cre 酵素はウイルス粒子内の hiv-1 プロテアーゼは活性化が成熟するギャグのエンベロープタンパク質内に挿入される前駆体として行われます。したがって、Cre 配信は、ターゲット セルを介してウイルスの膜融合過程にプロテアーゼ活性化 HIV 1 粒子の内容の配信によって異なります。プロトコルの 2 つのバージョンは、ここで提供されます。最初は、HIV の直接の細胞間伝播を研究に標的細胞に感染するのに HIV-1 感染人口を使用します。2 番目のバージョンは、携帯無料のウイルスを研究するのに携帯無料のウイルスを使用します。細胞間伝達アッセイは、セルがフリーズ解除日から 7 日間または 5 日間場合セルはすでに解凍され、継代を取ります。無細胞感染試験は、細胞の解凍し、継代細胞を解凍する必要がある場合 5 日間、3 日間で実行できます。指示が Clevers ラボ10によって作成されたプラスミドを使用して目的のセル型 (既存 RG 対象のセルの行を使用していない) 場合で RG (赤・緑) ターゲット細胞ラインを生成するもあります。このアッセイでウイルス発現細胞とウイルス適切なバイオ セーフティの予防措置を取ることをお勧めします。このアッセイ BSL2 + 培養施設での感染部分を行っています。セルを修正した後は、標準的なフロー、フローサイトメトリーおよび顕微鏡施設で分析できます。
ここで説明画面への本法の適用する化合物の小説の HIV-1 ウイルス膜融合 (図 1) を阻害します。プリン受容体は、炎症性メディエーターです。当研究室は、プリン受容体非選択的阻害剤が HIV-1 ウイルス膜融合6の阻害剤として機能する実証されています。高スループットこのアッセイの使用率が新規 HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別できることを報告する.受容体のプリン クラスの阻害剤が HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤の新規クラスを表すことを示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5546</td>
			<td>Media for 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R0883</td>
			<td>Media for Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140-071</td>
			<td>Serum for 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Serum for Jurkat Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Penn/Strep used in both media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td>Used for Culture of Jurkat Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm Tissue Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>Used for Culture of 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Plates (tissue culture Treated)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>Used for fusion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyjet Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>Used to transfect 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-100ML</td>
			<td>Used in wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Trypsin Protease</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>For Trypsinization of 293 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VACA-1003</td>
			<td>For Nucleofection of Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque plus</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>17144002</td>
			<td>For Nucleofection of Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>For all tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P3020-CPS</td>
			<td>For all tissue culture and liquid handling steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter (0.45 micron)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHA033</td>
			<td>For filtration of virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile syringes</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>309656</td>
			<td>For filtration of virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>2b</td>
			<td>for Nucleofection of Jurkats (various models available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>for flow cytometry analyss of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td>Fortessa 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>32702</td>
			<td>Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCL10a1</td>
			<td>Novus Bio</td>
			<td>NBP2-29542</td>
			<td>Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag-iCre</td>
			<td>Benjamin Chen Lab</td>
			<td></td>
			<td>Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of hiv-1 viral membrane fusion

この試金は流れの cytometry または蛍光顕微鏡による特に HIV 1 融合による緑色蛍光タンパク質 (GFP) 検出の式を報告する設計されています。HIV 1 記者ウイルス (HIV 1 ギャグ-本院)、Cre リコンビナーゼをマトリックスとギャグ エンベロープタンパク質のキャプシド蛋白質間の HIV-1 ゲノムに挿入することによって生成されます。ウイルス粒子に Cre リコンビナーゼ標的細胞にそれから解放されるこれのパッケージでこの結果の行、Cre リコンビナーゼ アクティブ赤色けい光たんぱく質 (RFP) GFP スイッチ カセットを安定に発現します。基底状態でこのカセットでは、RFP だけを表しています。次の標的細胞に Cre リコンビナーゼの配信、loxP サイトが並ぶ、RFP を切り取る、GFP の表現の結果します。この試金は無料のセル、セルを感染システムでウイルスのエントリ (特にの融合手順) の阻害剤をテストする使用ことができ、HIV-1 ウイルス膜融合の阻害物質としてプリン受容体拮抗薬のクラスを識別するために使用されています。

感染していない RG Jurkat 細胞は非常に強力な RFP の信号 (図 2 a、感染していない列) と背景 GFP 信号 (0.3%) の低レベルを展示します。ギャグ本院感染原因 1 HIV 融合阻害剤 AMD3100 の存在で GFP シグナル (24.9%) の増加 (20 μ M) は、この信号を感染していない背景レベル (0.34%) にまでもたらすの開発を阻害します。時逆転写阻害剤 AZT など後の融合イベン?...

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A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

HIV 1 融合を介して流れ cytometry または蛍光顕微鏡による検出可能な緑の蛍光蛋白質の表現を報告する細胞に基づく試金を記述します。無料のセル、セルを感染システムでウイルスのエントリ (特にの融合手順) の阻害剤をテストする使用できます。

高スループットの Cre Lox 活性化ウイルスの膜融合アッセイの HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別するために

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

Research

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The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

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