Name: a high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of hiv-1 viral membrane fusion
Uploaded: 2018-08-14T14:00:00
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Esta pesquisa foi apoiada por subsídios NIAID/NIH AI112423 e NIH/NIGMS GM113885 para Benjamin K. Chen e NIH/NIAID K08-AI120806 de Talia H. Swartz. Gostaríamos de agradecer a faculdade de medicina de Icahn no Mount Sinai Dean do fluxo Cytometry CORE.

1. geração de linhas de células alvo
Nota: Este passo é opcional; se usando uma linha de célula de destino existente do RG, comece pela etapa 2.
<ol><li>Cotransfect um prato de 10cm confluente de 70% de 293T células11 [em 10 mL de meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS)] com pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE10 e pCL-10A112 (plasmídeo de embalagem) em um proporção de 1:...

<ol>
	<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+identifies+pharmacological+inhibitors+of+HIV+entry.">A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry.</a> Virology. 490, 6-16 (2016).</li><li>Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+enzyme-based+assay+detecting+HIV-1+virion+fusion+in+primary+T+lymphocytes.">A sensitive and specific enzyme-based assay detecting HIV-1 virion fusion in primary T lymphocytes.</a> Nature Biotechnology. 20, 1151-1154 (2002).</li><li>Huerta, L., Lamoyi, E., Baez-Saldana, A., Larralde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+envelope-dependent+cell-cell+fusion:+a+quantitative+fluorescence+cytometric+assay.">Human immunodeficiency virus envelope-dependent cell-cell fusion: a quantitative fluorescence cytometric assay.</a> Cytometry. 47, 100-106 (2002).</li><li>Sakamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+HIV+cell-cell+fusion+assay+by+using+two+genetically+modified+HeLa+cell+lines+and+reporter+gene.">Establishment of an HIV cell-cell fusion assay by using two genetically modified HeLa cell lines and reporter gene.</a> Journal of Virological Methods. 114, 159-166 (2003).</li><li>Herschhorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+cell-cell+fusion+system+with+integrated+ability+to+measure+the+efficiency+and+specificity+of+HIV-1+entry+inhibitors.">An inducible cell-cell fusion system with integrated ability to measure the efficiency and specificity of HIV-1 entry inhibitors.</a> PLoS One. 6, e26731 (2011).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88, 11504-11515 (2014).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+HIV-Cell+Fusion+Assay+for+Discovery+of+Virus+Entry+Inhibitors.">High-Throughput HIV-Cell Fusion Assay for Discovery of Virus Entry Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13, 155-166 (2015).</li><li>Giroud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Functional+Profiling+of+Small-Molecule+HIV-1+Entry+and+Fusion+Inhibitors.">Screening and Functional Profiling of Small-Molecule HIV-1 Entry and Fusion Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 15, 53-63 (2017).</li><li>Hubner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> Journal of Virology. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9, 81-83 (2011).</li><li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+Rapid+production+of+helper-free,+high+titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Phosphate+Transfection.">Calcium Phosphate Transfection.</a> Current Protocols in Immunology. 10, 10-13 (2001).</li></ol>

O ensaio de Gag-iCre tem provado para ser muito útil para a seleção de candidatos a fármacos que podem inibir a etapa de fusão da replicação viral. Ao executar este teste, os mais importantes passos para obter um bom sinal são semelhantes aos ensaios de infecção virais mais. O primeiro passo crítico está produzindo altos títulos de vírus de boa qualidade. Esta etapa exige que as células 293T são passadas com frequência (pelo menos 1 x cada 48h) para que eles não se tornam overconfluent e aglutinar-se. A...

A necessidade de terapias anti-retrovirais romance tem solicitado o desenvolvimento de telas de alta produtividade para inibidores de entrada HIV-1. O ensaio da repórter Gag-iCre é desenvolvido para identificar inibidores de entrada viral na etapa de fusão em um sistema de infecção de célula para célula medindo especificamente a fusão da membrana viral com a membrana celular de anfitrião1. Um ensaio foi desenvolvido para triagem de novos inibidores que agiu especificamente nas fases iniciais da infecção do HIV-1 até o ponto de fusão da membrana viral. Um desafio para a infecção de célula-célula de medição é que o inóculo inicial contém células de doadores infectados e nas células-alvo ininfected, por medição nova infecção é difícil discriminar a partir das células de entrada. O sistema ideal envolveria um gene heterólogo marcador que pode ser induzido pelo início de uma infecção de célula de destino e não estiver presente na célula doadora. Um conteúdo viral popular mistura ensaio baseado em uma fusão de proteína-enzima viral, BlaM-Vpr, pode ser eficaz, mas tem limitações para a alta taxa de transferência, a célula-célula de triagem2. Este teste envolve um gene repórter de beta-lactamase (BlaM) que é fundido ao HIV-1 Vpr, empacotado em virions e entregue nas células de destino após a fusão da membrana viral. O substrato CCF2-AM é carregado no citoplasma das células-alvo e sofre uma mudança de fluorescência após clivagem. O substrato CCF2-AM é caro e pode ser proibitivo para telas de alta produtividade. Para distinguir células do doador e de destino, é necessário a tintura-etiqueta as populações-alvo. Finalmente, o protocolo exige várias etapas de lavagem e incubação, que podem ser pesada e onerosa ao testar um grande número de compostos.
O ensaio de Gag-iCre foi desenvolvido como uma solução para estes problemas, para desenvolver um elevado-throughput screening para inibidores de fusão em transmissão de célula para célula. Este sistema não requer substrato para ser carregado em células. O ensaio também pode ser usado para estudos de célula-free e é adaptável a outros estudos de fusão viral usando partículas de vírus HIV-1 Gag-iCre pseudo digitadas. Ensaios de fusão do HIV Env mediada celular podem medir fusão de celular mediada por proteínas do vírus Env, no entanto, estas não usar partículas de vírus real, como o teste de HIV-1 Gag-iCre faz3,4,5. Este ensaio pode ser lido com microscopia de fluxo cytometry ou fluorescência. Foi utilizado com sucesso para a tela da biblioteca do FDA, bem como uma pequena biblioteca de purinérgicos inibidores1,6. Outros pesquisadores também identificaram purinérgicos inibidores de fusão do HIV-1 usando um ensaio de fusão de alta produtividade adaptado e otimizado que relata a transferência de beta-lactamase encapsulado vírus para o citoplasma7,8 .
O vírus de Gag-iCre foi projetado com uma abordagem semelhante ao vírus da mordaça-iGFP, inserindo Cre recombinase entre matriz e capsídeo, ladeado por HIV-1 protease sites9. A enzima de Cre é feita como um precursor inserido dentro a poliproteína de mordaça que amadurece quando a protease do HIV-1 é ativado dentro da partícula do vírus nascente. A entrega de Cre depende, assim, a entrega do conteúdo de uma partícula de HIV-1 protease-ativado em um alvo celular através de um processo de fusão da membrana viral. Duas versões do protocolo são fornecidas aqui. O primeiro usa uma população de HIV-1 infectado para infectar células-alvo, para estudar a transmissão directa de célula para célula do HIV. A segunda versão utiliza um vírus sem célula para estudar uma infecção sem célula viral. O ensaio de transmissão de celular para celular leva 7 dias para concluir a partir do dia em que as células são descongeladas, ou 5 dias, se as células são já descongeladas e passadas. O ensaio de infecção sem célula pode ser executado em 5 dias, se as células precisam ser descongelados e 3 dias, se as células são descongeladas e passadas. Também são dadas instruções para gerar uma linha de células alvo (vermelho-verde) RG no tipo celular desejado (se uma linhagem de células de destino preexistente do RG não estiver sendo usada) utilizando um plasmídeo criado pelo laboratório Clevers10. É recomendável que sejam tomadas precauções de biossegurança adequadas com o vírus e as células do vírus-expressando neste ensaio. Realizamos a parte infecciosa deste ensaio em uma instalação de cultura de tecidos BSL2 +. Depois que as células são fixos, eles podem ser analisados nas instalações de microscopia e citometria de fluxo padrão.
Aqui descrevemos a aplicação deste teste a tela para romance compostos que inibem a fusão da membrana viral de HIV-1 (Figura 1). Receptores purinérgicos são mediadores pró-inflamatórios. Nosso laboratório tem demonstrado que os inibidores não-seletivo dos receptores purinérgicos agem como inibidores de fusão de membrana viral HIV-16. Informamos que a utilização deste teste em alta taxa de transferência pode identificar novos inibidores de fusão de membrana viral de HIV-1. Podemos demonstrar que um inibidor da classe dos receptores purinérgicos representa uma nova classe de inibidores de fusão da membrana viral HIV-1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5546</td>
			<td>Media for 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R0883</td>
			<td>Media for Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140-071</td>
			<td>Serum for 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Serum for Jurkat Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Penn/Strep used in both media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td>Used for Culture of Jurkat Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm Tissue Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>Used for Culture of 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Plates (tissue culture Treated)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>Used for fusion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyjet Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>Used to transfect 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-100ML</td>
			<td>Used in wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Trypsin Protease</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>For Trypsinization of 293 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VACA-1003</td>
			<td>For Nucleofection of Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque plus</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>17144002</td>
			<td>For Nucleofection of Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>For all tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P3020-CPS</td>
			<td>For all tissue culture and liquid handling steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter (0.45 micron)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHA033</td>
			<td>For filtration of virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile syringes</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>309656</td>
			<td>For filtration of virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>2b</td>
			<td>for Nucleofection of Jurkats (various models available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>for flow cytometry analyss of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td>Fortessa 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>32702</td>
			<td>Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCL10a1</td>
			<td>Novus Bio</td>
			<td>NBP2-29542</td>
			<td>Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag-iCre</td>
			<td>Benjamin Chen Lab</td>
			<td></td>
			<td>Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of hiv-1 viral membrane fusion

Este ensaio destina-se especificamente informar sobre HIV-1 fusão através da expressão da proteína verde fluorescente (GFP) detectável pela microscopia de fluxo cytometry ou fluorescência. Um vírus de repórter de HIV-1 (HIV-1 Gag-iCre) é gerado inserindo o genoma do HIV-1 entre a matriz e as proteínas do capsídeo da poliproteína mordaça Cre recombinase. Isso resulta em uma embalagem de Cre recombinase em partículas de vírus, que em seguida é lançado em uma célula alvo linha estàvel, expressando uma Cre recombinase ativado vermelha proteína fluorescente (RFP) para gaveta de interruptor GFP. No estado basal, esta fita expressa RFP apenas. Após a entrega da Cre recombinase para a célula de destino, a RFP, ladeado por sites loxP, excises, resultando na expressão de GFP. Este ensaio pode ser usado para testar qualquer inibidores da entrada viral (especificamente na etapa de fusão) em sistemas de infecção sem célula e célula para célula e tem sido usado para identificar uma classe de antagonistas dos receptores purinérgicos como romance inibidores de fusão de membrana viral do HIV-1.

Não infectados RG Jurkat células apresentam um baixo nível de sinal GFP de fundo (0,3%) com um sinal muito forte de RFP (Figura 2A, coluna não infectada). A infecção com mordaça-iCre provoca um aumento no sinal GFP (24,9%), enquanto a presença de inibidor de fusão do HIV-1 AMD3100 (20 µM) inibe o desenvolvimento deste sinal, trazendo-a para baixo aos níveis de fundo não infectados (0,34%). Quando um inibidor de um evento pós-fusão, como o inibid...

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A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Descrevemos um ensaio baseados em células para relatório sobre HIV-1 fusão através da expressão da proteína verde fluorescente detectável por microscopia de fluxo cytometry ou fluorescência. Ele pode ser usado para testar a inibidores de entrada viral (especificamente na etapa de fusão) em sistemas de infecção sem célula e célula a célula.

Um elevado-throughput Cre-Lox ativado ensaio de fusão da membrana Viral para identificar inibidores de fusão da membrana Viral do HIV-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

Research

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The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

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Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

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The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

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