Name: a high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of hiv-1 viral membrane fusion
Uploaded: 2018-08-14T14:00:00
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Esta investigación fue apoyada por subvenciones NIH/NIAID AI112423 NIH/NIGMS GM113885 a Benjamin K. Chen y NIH/NIAID K08-AI120806 a Talia H. Swartz. Nos gustaría agradecer a la Facultad de medicina de Icahn en el Monte Sinaí Dean flujo Cytometry base.

1. generación de líneas de células de la blanco
Nota: Este paso es opcional; Si utiliza una línea de celular de destino RG existente, iniciar en el paso 2.
<ol><li>Cotransfect una placa de 10 cm confluentes de 70% de células 293T11 [en 10 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS)] con pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE10 y pCL-10A112 (plásmido de embalaje) en un relación...

<ol>
	<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+identifies+pharmacological+inhibitors+of+HIV+entry.">A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry.</a> Virology. 490, 6-16 (2016).</li><li>Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+enzyme-based+assay+detecting+HIV-1+virion+fusion+in+primary+T+lymphocytes.">A sensitive and specific enzyme-based assay detecting HIV-1 virion fusion in primary T lymphocytes.</a> Nature Biotechnology. 20, 1151-1154 (2002).</li><li>Huerta, L., Lamoyi, E., Baez-Saldana, A., Larralde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+envelope-dependent+cell-cell+fusion:+a+quantitative+fluorescence+cytometric+assay.">Human immunodeficiency virus envelope-dependent cell-cell fusion: a quantitative fluorescence cytometric assay.</a> Cytometry. 47, 100-106 (2002).</li><li>Sakamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+HIV+cell-cell+fusion+assay+by+using+two+genetically+modified+HeLa+cell+lines+and+reporter+gene.">Establishment of an HIV cell-cell fusion assay by using two genetically modified HeLa cell lines and reporter gene.</a> Journal of Virological Methods. 114, 159-166 (2003).</li><li>Herschhorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+cell-cell+fusion+system+with+integrated+ability+to+measure+the+efficiency+and+specificity+of+HIV-1+entry+inhibitors.">An inducible cell-cell fusion system with integrated ability to measure the efficiency and specificity of HIV-1 entry inhibitors.</a> PLoS One. 6, e26731 (2011).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88, 11504-11515 (2014).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+HIV-Cell+Fusion+Assay+for+Discovery+of+Virus+Entry+Inhibitors.">High-Throughput HIV-Cell Fusion Assay for Discovery of Virus Entry Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13, 155-166 (2015).</li><li>Giroud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Functional+Profiling+of+Small-Molecule+HIV-1+Entry+and+Fusion+Inhibitors.">Screening and Functional Profiling of Small-Molecule HIV-1 Entry and Fusion Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 15, 53-63 (2017).</li><li>Hubner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> Journal of Virology. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9, 81-83 (2011).</li><li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+Rapid+production+of+helper-free,+high+titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Phosphate+Transfection.">Calcium Phosphate Transfection.</a> Current Protocols in Immunology. 10, 10-13 (2001).</li></ol>

El ensayo de Gag-iCre ha demostrado para ser muy útil para la detección de candidatos de drogas que pueden inhibir el paso de la fusión de la replicación viral. Al realizar este ensayo, los pasos más importantes para obtener una buena señal son similares a ensayos más virales de la infección. El primer paso crítico es producción de altos títulos de virus de buena calidad. Este paso requiere que las células 293T son pasados con frecuencia (al menos 1 x cada 48 h) para que no se convierten en overconfluent y ag...

La necesidad de terapias antirretrovirales novela impulsó el desarrollo de pantallas de alto rendimiento de inhibidores de la entrada HIV-1. El ensayo de reportero de Gag-iCre está desarrollado para identificar inhibidores de entrada viral en la etapa de fusión en un sistema de infección de célula a célula por medir específicamente la fusión de la membrana viral con la membrana de la célula anfitrión del1. Se desarrolló un ensayo para detectar nuevos inhibidores que actúan específicamente en las primeras etapas de la infección VIH-1 hasta el punto de fusión de la membrana viral. Un reto para la infección de la célula de medición es que el inóculo inicial contiene células de un donante infectado y células blanco ininfected, para que medición de nueva infección es difícil de diferenciar de las células de entrada. El sistema ideal implicaría un marcador de gen heterólogo que puede ser inducido por el inicio de una infección de la célula objetivo y no está presente en la célula donante. Un contenido viral popular mezcla ensayo basado en la fusión de la proteína-enzima viral, BlaM-Vpr, puede ser eficaz, pero tiene limitaciones para alto rendimiento, proyección de célula2. Este ensayo consiste en un gen reportero de beta-lactamasa (BlaM) que está unido a los HIV-1 Vpr, empaquetado en viriones y entregado a las células diana sobre la fusión de la membrana viral. El substrato CCF2-AM se carga en el citoplasma de las células diana y somete a un cambio de fluorescencia al escote. El substrato CCF2-AM es costoso y puede ser prohibitivo para pantallas de alto rendimiento. Para distinguir las células de donante y el destino, es necesario tinte-etiqueta las poblaciones destinatarias. Finalmente, el protocolo requiere varios pasos de lavado e incubación que pueden ser gravoso y costoso cuando gran número de compuestos.
El ensayo de Gag-iCre fue desarrollado como una solución a estos problemas, para desarrollar un alto rendimiento de inhibidores de la fusión en la transmisión de célula a célula. Este sistema no requiere de sustrato en las células. El ensayo también puede utilizarse para estudios sin células y es adaptable a otros estudios de fusión viral utilizando pseudo-con las partículas del virus HIV-1 Gag-iCre. Ensayos de fusión de VIH Env mediada por célula pueden medir virus Env celular mediada por la proteína de la fusión, sin embargo estos no utilizan partículas del virus real como el análisis de HIV-1 Gag-iCre hace3,4,5. Este ensayo se puede leer con microscopía de flujo cytometry o fluorescencia. Se ha utilizado con éxito para la biblioteca de la FDA, así como una pequeña biblioteca de purinérgicos inhibidores1,6. Otros investigadores también han identificado inhibidores purinérgicos en la fusión del VIH-1 mediante un ensayo de fusión de alto rendimiento adaptado y optimizado que informa de la transferencia de virus encapsulado de beta-lactamasa en el citoplasma7,8 .
El virus Gag-iCre fue diseñado con un enfoque similar al virus Gag-iGFP, insertar recombinase de Cre entre matriz y cápside, flanqueado por la proteasa de HIV-1 sitios9. La enzima Cre se hace como un precursor que se inserta dentro de la poliproteína Gag que madura cuando se activa la proteasa VIH-1 dentro de la partícula del virus naciente. Por lo tanto, la entrega de Cre es dependiente sobre la entrega de los contenidos de una partícula de VIH-1 proteasa activada en un destino celular mediante un proceso de fusión de la membrana viral. Se incluyen dos versiones del protocolo. La primera utiliza una población de infectados por VIH-1 para infectar a las células diana, para estudiar la transmisión directa de célula a célula del VIH. La segunda versión utiliza un virus libres de células para el estudio de una infección viral sin células. El ensayo de transmisión de célula a célula toma 7 días desde el día que las células son descongeladas, o 5 días si las células son ya descongeladas y pasadas. El análisis sin células de la infección se puede realizar en 3 días y 5 días si las células necesitan ser descongelado si las células son descongeladas y pasadas. También está indicado para generar una línea de celular de target (rojo a verde) de RG en el tipo de célula deseada (si no se utiliza una línea de celular de destino RG preexistente) usando un plásmido creado por el laboratorio de Clevers10. Se recomienda que se toman las precauciones de bioseguridad apropiado con el virus y las células virus-expresión en este ensayo. Llevamos a cabo la parte infecciosa de este ensayo en un centro de cultivo de tejidos BSL2 +. Después de que las células son fijos, pueden ser analizadas en las instalaciones de microscopia y citometría de flujo estándar.
Aquí se describe la aplicación de este ensayo a pantalla a novela compuestos que inhiben la fusión de la membrana viral de VIH-1 (figura 1). Receptores purinérgicos son mediadores pro-inflamatorios. Nuestro laboratorio ha demostrado que los inhibidores no selectivos de los receptores purinérgicos actúan como inhibidores de fusión de la membrana viral VIH-16. Divulgamos que la utilización de este ensayo de alto rendimiento puede identificar nuevos inhibidores de fusión de membrana viral VIH-1. Demostramos que un inhibidor de la clase purinérgicos de receptores representa una nueva clase de inhibidores de fusión de la membrana viral de VIH-1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5546</td>
			<td>Media for 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R0883</td>
			<td>Media for Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140-071</td>
			<td>Serum for 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Serum for Jurkat Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Penn/Strep used in both media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td>Used for Culture of Jurkat Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm Tissue Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>Used for Culture of 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Plates (tissue culture Treated)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>Used for fusion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyjet Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>Used to transfect 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-100ML</td>
			<td>Used in wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Trypsin Protease</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>For Trypsinization of 293 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VACA-1003</td>
			<td>For Nucleofection of Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque plus</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>17144002</td>
			<td>For Nucleofection of Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>For all tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P3020-CPS</td>
			<td>For all tissue culture and liquid handling steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter (0.45 micron)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHA033</td>
			<td>For filtration of virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile syringes</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>309656</td>
			<td>For filtration of virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>2b</td>
			<td>for Nucleofection of Jurkats (various models available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>for flow cytometry analyss of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td>Fortessa 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>32702</td>
			<td>Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCL10a1</td>
			<td>Novus Bio</td>
			<td>NBP2-29542</td>
			<td>Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag-iCre</td>
			<td>Benjamin Chen Lab</td>
			<td></td>
			<td>Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of hiv-1 viral membrane fusion

Este ensayo está diseñado para específicamente Informe VIH-1 la fusión a través de la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) detectable por microscopia de flujo cytometry o fluorescencia. Un virus de reportero de HIV-1 (HIV-1 Gag-iCre) genera insertando recombinase de Cre en el genoma del VIH-1 entre la matriz y las proteínas de la cápside de la poliproteína Gag. Esto resulta en un envase del recombinase de Cre en las partículas del virus, que luego se lanza en una célula objetivo línea estable expresando una Cre recombinase rojo fluorescente proteína activada (RFP) en casete de interruptor GFP. En estado basal, este cassette expresa RFP sólo. Tras la entrega del recombinase de Cre en la célula diana, la RFP, flanqueado por sitios loxP, accisas, dando por resultado la expresión de GFP. Este ensayo puede usarse para probar cualquier inhibidores de entrada viral (específicamente en la etapa de fusión) en sistemas libres de células y células a la infección y se ha utilizado para identificar una clase de antagonistas de los receptores purinérgicos como nuevos inhibidores de la fusión de la membrana viral VIH-1.

Células de Jurkat RG no infectadas exhiben un bajo nivel de señal de fondo GFP (0.3%) con una señal muy fuerte de la RFP (figura 2A, columna no infectada). La infección con mordaza-iCre provoca un aumento en la señal GFP (24,9%), mientras que la presencia del inhibidor de la fusión del VIH-1 AMD3100 (20 μm) inhibe el desarrollo de esta señal, llevándola a niveles de fondo no infectada (0,34%). Cuando un inhibidor de un evento de la fusión tales como...

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A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Se describe un ensayo basado en células para reportar VIH-1 la fusión a través de la expresión de la proteína verde fluorescente detectable por microscopía de flujo cytometry o fluorescencia. Puede ser utilizado para probar los inhibidores de entrada viral (específicamente en la etapa de fusión) en sistemas libres de células y células a la infección.

Un alto rendimiento Cre-Lox activado análisis de fusión de la membrana Viral para identificar inhibidores de la fusión de la membrana Viral VIH-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

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