Name: using 22c3 anti-pd-l1 antibody concentrate on biopsy and cytology samples from non-small cell lung cancer patients
Uploaded: 2018-09-25T15:00:00
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Cette étude a été commanditée par Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique local (Human Research Ethics Committee, Centre Hospitalier Universitaire de Nice/Tumorothèque BB-0033-00025).
Remarque : Ce protocole est réglé spécifiquement pour l’utilisation du concentré 22 3 anticorps sur un stainer d’IHC automatisé disponible dans le commerce (appelée pour comme autostainer ici, voir la Table des matières) pour biopsie de la tumeur et les échantillons de cytologie....

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	<li>Garon, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+for+the+treatment+of+non-small-cell+lung+cancer.">Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (21), 2018-2028 (2015).</li><li>Herbst, R. 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G., Skov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+Comparison+of+PD-L1+Expression+on+Cytologic+and+Histologic+Specimens+From+Malignancies+in+the+Lung+Assessed+With+PD-L1+IHC+28-8pharmDx+and+PD-L1+IHC+22C3pharmDx.">Paired Comparison of PD-L1 Expression on Cytologic and Histologic Specimens From Malignancies in the Lung Assessed With PD-L1 IHC 28-8pharmDx and PD-L1 IHC 22C3pharmDx.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 25 (7), 453-459 (2017).</li><li>Russell-Goldman, E., Kravets, S., Dahlberg, S. E., Sholl, L. M., Vivero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytologic-histologic+correlation+of+programmed+death-ligand+1+immunohistochemistry+in+lung+carcinomas.">Cytologic-histologic correlation of programmed death-ligand 1 immunohistochemistry in lung carcinomas.</a> Cancer Cytopathology. 126 (4), 253-263 (2018).</li><li>Heymann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+non-small+cell+lung+carcinoma:+Comparison+among+cytology,+small+biopsy,+and+surgical+resection+specimens.">PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens.</a> Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).</li><li>Stoy, S. P., Rosen, L., Mueller, J., Murgu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-ligand+1+testing+of+lung+cancer+cytology+specimens+obtained+with+bronchoscopy.">Programmed death-ligand 1 testing of lung cancer cytology specimens obtained with bronchoscopy.</a> Cancer Cytopathology. 126 (2), 122-128 (2018).</li><li>Ilie, M., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+PD-L1+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer-know+your+limits+but+never+stop+trying+to+exceed+them.">Reproducibility of PD-L1 assessment in non-small cell lung cancer-know your limits but never stop trying to exceed them.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (Suppl 1), S51-S54 (2017).</li></ol>

Nous avons validé une LDT optimisée à l’aide du concentré d’anticorps 22 3 PD-L1, en le comparant avec les correspondants des essais commerciaux validés cliniquement10,11. Les 3 22 concentrés LDT à base d’anticorps ont montré un taux élevé de concordance entre la biopsie (~ 100 %) et les échantillons de cytologie (~ 95 %) par rapport à l’expression de PD-L1 IHC déterminée en utilisant le test IHC PD-L1 22 3 ≥ 1 % TPS tant la ≥50 % TPS po...

Des essais cliniques récents ont démontré l’efficacité de pembrolizumab, un anticorps monoclonal IgG4 kappa isotype anticorps humanisé qui bloque l’interaction entre la mort cellulaire programmée 1 (PD-1) et ses ligands, PD-L1 et L2-PD, dans le traitement des patients atteints de Advanced NSCLC1,2,3,4.
Actuellement, pembrolizumab est approuvé pour le traitement de NSCLC PD-L1-exprimant chez les deux patients naïfs de tout traitement avec une expression de PD-L1 TPS de ≥50 % et aucun récepteur de facteur de croissance épidermique (EGFR) ou les aberrations de génomique tumorale anaplastic lymphoma kinase (ALK)3 et pour précédemment traités avec un TPS de PD-L1 de ≥ 1 %1.
PD-L1 expression de la protéine détectée par IHC a été largement utilisée comme un dosage de biomarqueurs prédictifs des thérapies anti-PD-1/PD-L1. Dans les essais cliniques pembrolizumab, le TPS de PD-L1 obtenue avec fixés au formol des échantillons de tissus (FFIP) paraffine a déterminé en utilisant le PD-L1 IHC 22 3 compagnon essai5. Cet essai a été approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) et a été marqué en Europe pour la détermination de la tumeur PD-L1 TPS5.
Les options globales supplémentaires dans des institutions pour des évaluations fiables et de qualité de la TPS de PD-L1 avec tdl qui utilisent le concentré d’anticorps 22 3 sont essentielles pour appuyer les décisions cliniques concernant le patient d’admissibilité pour pembrolizumab traitement. Un grand nombre de laboratoires de pathologie n’ont pas accès à l’analyse de l’IHC PD-L1 22 3 diagnostic compagnon. Par conséquent, le développement des TDL fiable et cohérent compatible avec les plateformes d’autostainer IHC supplémentaires, largement disponibles est essentiel.
Par ailleurs, il y a une nécessité d’établir des TDL en utilisant des échantillons de cytologie qui sont le seul spécimen type fréquemment disponible de patients atteints de CBNPC. L’essai de compagnon de PD-L1 IHC 22 3 est validé pour les résections, biopsies à l’aiguille centrale et bronchoscopies seulement si la bronchoscopie donne 100 cellules tumorales. Bien que les types d’échantillon ci-dessus sont souvent obtenus, échantillons cytologiques sont plus facilement perçus et sont le type d’échantillon plus couramment disponible dans certains établissements6,7. Cependant, il n’y a actuellement aucun test diagnostique validé disponibles pour l’évaluation de l’expression de PD-L1 dans des échantillons de cytologie ; TDL fiable compatible avec les échantillons de cytologie faciliterait davantage qualité PD-L1 test.
En outre, lors de l’établissement la validation clinique d’une LDT, l’IHC doit être effectuée de façon similaire au test commercial cliniquement validé correspondant8. Par exemple, plusieurs étapes critiques doivent être vérifiées pour obtenir le même signal dans des coupes sériées comme un titrage d’anticorps, retards de prétraitement, temps d’incubation et amplification systèmes9.
Nous avons récemment développé une LDT optimisée qui utilise le concentré 22 3 anticorps pour évaluer l’expression de PD-L1 sur les biopsies de tumeurs et cytologie échantillons10,11. Nous avons constaté une forte concordance avec la LDT contre le « gold standard » PD-L1 IHC 3 22 dosage10,11. Ce protocole cliniquement validé soutiendra PD-L1 fiables et de haute qualité, stable dans toutes les régions dans le monde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NovaPrep HQ1</td>
			<td>Novacyt</td>
			<td>NA</td>
			<td>Preservative solution for cytology specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaprep&#174; HQ+ B</td>
			<td>Novacyt</td>
			<td>NA</td>
			<td>Mucolytic solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek VIP 6</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6042 VIP 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>5229 TEC 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope glass slide SuperFrost Plus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4951PLUS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Multi Reax Vortex Shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-889-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cytoblock</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7401150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>#M365329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-L1 IHC 22C3 pharmDx</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>SK006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autostainer Link 48</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>AS480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark ULTRA autostainer</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView HQ Universal Linker</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView HRP Multimer</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Amplification H2O2</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Amplifier</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Amplification Multimer</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView DAB</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Copper</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin II</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#790-2208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluing Reagent</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-2037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Conditioning 1 (CC1)</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#950-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Film Coverslipper</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4742</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using 22c3 anti-pd-l1 antibody concentrate on biopsy and cytology samples from non-small cell lung cancer patients

Pembrolizumab en monothérapie a été approuvé pour le traitement de première et deuxième ligne des patients atteints de cancer PD-L1-exprimant avancé de poumon de non à petites cellules (CPNPC). Essais pour PD-L1 expression avec le PD-L1 immunohistochimie (IHC) 22 3 test diagnostique compagnon, qui donne une proportion de tumeur marquer (TPS), a été validé sur un tissu tumoral. Nous avons développé un optimisé test laboratoire avancés (LDT) qui utilise le concentré 22 3 anticorps (AC) sur un appareil IHC largement disponible pour les spécimens de biopsie et cytologie. Le TPS de PD-L1 a été évalué avec 120 sections appariées ensemble-tumeur tissulaire et des échantillons de biopsie et avec 70 appariés échantillons de biopsie et cytologie (lavages bronchiques, n = 40 ; des épanchements pleuraux, n = 30). Les 22 3 que LDT axée sur le concentré a montré un taux élevé de concordance entre la biopsie (~ 100 %) et de la cytologie des spécimens (~ 95 %) en comparaison avec PD-L1 IHC expression déterminée à l’aide du test de 22 3 compagnon PD-L1 IHC à deux TPS Découpez points (≥ 1 % et ≥ 50 %). La LDT optimisée présentée ici, à l’aide du concentré de Ab 22 3 déterminer l’expression de PD-L1 dans les deux tissus tumoraux et dans les échantillons de cytologie, augmentera la capacité des laboratoires dans le monde entier pour évaluer l’admissibilité des patients atteints de CBNPC pour un traitement par pembrolizumab en monothérapie d’une manière fiable et reproductible.

À l’aide de la procédure présentée ici et comme le décrit en détail dans récentes publications10,11 de ce groupe, la LDT optimisée a été cliniquement validée avec 120 échantillons de biopsie FFPE NSCLC d’archives provenant de patients ayant subi une chirurgie résection ou une biopsie à l’hôpital universitaire de Pasteur, Nice, entre mars 2007 et mars 2016. En outre, pour l’évaluation d’expression PD-L1 de...

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Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Avec 22 3 anticorps Anti-PD-L1 se concentrent sur la biopsie et cytologie échantillons provenant de patients atteints de Cancer de poumon Non à petites cellules

Pour développer la capacité des laboratoires dans le monde entier pour évaluer l’admissibilité des patients atteints de cancer du poumon pour un traitement par pembrolizumab, d’une manière fiable et reproductible, nous avons développé un test qui utilise le concentré 22 3 anticorps sur un largement disponible autostainer immunohistochimique, pour les spécimens de biopsie et la cytologie.

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Cette méthode utilisant le concentré d’anticorps 22C3 pour déterminer l’expression de PD-L1 dans le tissu de tumeur et le spécimen de cytologie élargira la capacité des laboratoires d’évaluer la sélection des patients présentant le cancer de poumon non-petites cellules pour l’immunothérapie d’une manière fiable et reproductible. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est très concordante avec l’analyse de l’étalon-or et qu’elle prendra en charge des tests PD-L1 fiables et de haute qualité dans toutes les régions du monde. En général, les pathologistes nouveaux à cette méthode auront du mal en raison de la coloration granulaire parfois observée.En outre, la coloration des cellules humaines est un peu plus intense que celle observée avec l’étalon-or. Par conséquent, la formation des pathologistes est nécessaire pour obtenir une interprétation correcte de la coloration PD-L1 avec le LDT 22C3. La démonstration de la procédure sera MmeMarame Hamila, technicienne de mon labo. Pour commencer, fixez le tissu tumoral en formaline tamponnée à 10 % dans une cassette et intégriez la cassette dans la paraffine telle qu’elle est décrite dans le protocole textuel. Intégrer le tissu infiltré à l’intérieur d’un moule rempli de paraffine fondue.Laissez le tissu rester dans le moule jusqu’à ce que la paraffine se soit solidifiée. Après cela, utilisez une microtome pour sectionner le tissu incorporé paraffine à une épaisseur de trois micromètres. Transférer le ruban de paraffine sur une lame de microscope en verre chargée positivement.Ensuite, séchez la glissade pendant une heure à 37 degrés Celsius. Tout d’abord, recueillir les lavages bronchiques dans une solution de conservation. Transférer les lavages dans un tube conique de 50 millilitres.Ajouter deux grammes de DL-Dithiothreitol et vortex le tube pendant 30 minutes, puis centrifugeuse à 250 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Retirer le supernatant et ajouter 10 millilitres d’une solution mucolytique. Agiter l’échantillon à vitesse moyenne pendant 20 minutes et centrifuger à 250 fois g pendant cinq minutes à température ambiante.Après cela, retirez le supernatant et déposez la pastille cellulaire dans un tube de collecte contenant de la formaline tamponnée à 10 %. Ajouter quatre gouttes d’un agent de préparation du bloc cellulaire. Transférer la pastille cellulaire sur une cassette.Fixer la pastille cellulaire pour l’intégration de la paraffine et la sectionnement en utilisant le processus précédemment décrit pour la préparation des échantillons de tissu tumoral. Pour commencer, la puissance sur l’autostainer et l’ordinateur. Double clic sur l’icône autostainer et choisissez l’utilisateur.Cliquez sur Créer l’étiquette, puis sur protocole. Double clic sur le protocole 22C3. Remplissez l’iD du patient et cliquez sur Imprimer.Après cela, coller l’étiquette sur la diapositive. Appuyez sur le bouton sur le tiroir à glissière choisi pour l’ouvrir et placez la glissière étiquetée sur la garniture thermique avec l’étiquette orientée vers le haut et vers l’intérieur. Fermez le tiroir à glissière.Ensuite, retirez les bouchons des distributeurs. Chargez les reagents sur le rack des reagents. Ouvrez le capot du stainer et placez les supports de reagent sur le carrousel des reagents, en vous assurant qu’ils s’adaptent correctement et se tiennent en position, puis fermez le capot.Dans le logiciel, cliquez sur l’instrument qui sera utilisé, puis cliquez sur Exécution. À la fin de la procédure IHC, utilisez l’eau du robinet avec une seule goutte de solution de nettoyage pour rincer la lame pendant plusieurs secondes. Déshydratez la glissière en l’immergeant séquentiellement dans deux bains d’éthanol pendant plusieurs secondes chacun, puis placez la glissière dans une machine à couvrir pour charger automatiquement le glissement du couvercle.Pour commencer à évaluer la qualité de la coloration PD-L1, analyser les contrôles positifs et négatifs avant d’examiner l’échantillon du patient. À l’aide d’un microscope, confirmer la présence d’au moins 100 cellules tumorales viables. À un grossissement bas de 4 fois, évaluez tous les secteurs positifs et négatifs bien préservés de tumeur.Après ceci, marquez la coloration partielle ou complète de membrane cellulaire et calculez le score de proportion de tumeur en évaluant la proportion des cellules tumeurs PD-L1-positives par rapport à toutes les cellules de tumeur présentes dans les secteurs bien préservés de tumeur. Dans cette étude, le score de proportion de tumeur ou TPS est évalué pour des échantillons jumelés de biopsie de tissu dans les blocs de cellules préparés des lavages bronchiques ou des effusions pleurales. Des modèles représentatifs de coloration avec des spécimens de biopsie sont utilisés pour comparer le concentré d’anticorps 22C3 contre l’analyse compagnon PD-L1 IHC 22C3.Le coefficient de corrélation intraclassique, qui est utilisé pour mesurer la corrélation du score TPS en tant que variable continue, est de 99 % entre le LDT et l’étalon-or. Des modèles de coloration représentatifs avec des spécimens de cytologie sont également utilisés pour comparer le concentré d’anticorps 22C3 contre l’analyse compagnon PD-L1 IHC 22C3. Le taux de concordance des échantillons de biopsie et de cytologie avec le LDT est supérieur à 95 % lors de l’utilisation de l’un ou l’autre des points de coupe TPS.Le coefficient de corrélation intraclassique tout en utilisant TPS comme variable continue se situe entre 0,88 et 0,90. Une fois maîtrisée, cette technique donne un taux de concordance élevé avec l’étalon-or dans l’évaluation de la coupure pour la positivité ou l’histologie tumorale pour les échantillons de tissu et de cytologie. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que les échantillons doivent être évalués en référence à la diapositive HE et dans certains cas difficiles taches complémentaires pour évaluer les cellules immunitaires peuvent être effectuées pour exclure une mauvaise interprétation de l’expression PD-L1 dans les cellules tumorales seulement.Suite à cette procédure, d’autres spécimens comme les biopsies à aiguilles fines, les EUS-FNA ou les brosses bronchiques peuvent être évalués. Après sa mise en place dans les cliniques, la robustesse de l’analyse doit être maintenue au fil du temps en demandant l’accréditation, en suivant les procédures d’exploitation normalisées et en participant régulièrement à des programmes externes d’évaluation de la qualité. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en œuvre le protocole optimisé en utilisant l’anticorps anti-PD-L1 22C3 se concentrer sur un autostainer IHC largement disponible à la fois des échantillons de biopsie et de cytologie de patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules.

Research

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Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radiosensibilité des cellules souches cancéreuses dans les lignées cellulaires du cancer du poumon

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Détection de l’ADN sans cellules dans les échantillons de plasma sanguin des patients atteints de cancer

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolement et évaluation fonctionnelle des cellules souches du cancer du sein humain à partir d’échantillons de cellules et de tissus

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...