Name: using 22c3 anti-pd-l1 antibody concentrate on biopsy and cytology samples from non-small cell lung cancer patients
Uploaded: 2018-09-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients at JoVE.com

Questo studio è stato sponsorizzato da Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, Stati Uniti d'America. I finanziatori non ha svolto ruolo nel disegno di studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico locale (Comitato di etica umana ricerca, Centre Hospitalier Universitaire de Nizza/Tumorothèque BB-0033-00025).
Nota: Questo protocollo è specificamente regolato per l'uso di 22 3 anticorpo concentrato su un commercialmente disponibile stainer IHC automatizzato (denominato per come autostainer qui, vedere la Tabella materiali) per le biopsie del tumore e campioni di citologia.
1. preparazion...

<ol>
	<li>Garon, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+for+the+treatment+of+non-small-cell+lung+cancer.">Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (21), 2018-2028 (2015).</li><li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated,+PD-L1-positive,+advanced+non-small-cell+lung+cancer+(KEYNOTE-010):+a+randomised+controlled+trial.">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li><li>Reck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+versus+Chemotherapy+for+PD-L1-Positive+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).</li><li>Langer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboplatin+and+pemetrexed+with+or+without+pembrolizumab+for+advanced,+non-squamous+non-small-cell+lung+cancer:+a+randomised,+phase+2+cohort+of+the+open-label+KEYNOTE-021+study.">Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study.</a> The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).</li><li>Buttner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Death-Ligand+1+Immunohistochemistry+Testing:+A+Review+of+Analytical+Assays+and+Clinical+Implementation+in+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).</li><li>Folch, E., Costa, D. B., Wright, J., VanderLaan, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer+diagnosis+and+staging+in+the+minimally+invasive+age+with+increasing+demands+for+tissue+analysis.">Lung cancer diagnosis and staging in the minimally invasive age with increasing demands for tissue analysis.</a> Translational Lung Cancer Research. 4 (4), 392-403 (2015).</li><li>Padmanabhan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+Adequacy+of+Small+Biopsy+and+Fine-Needle+Aspiration+Specimens+for+Molecular+Testing+by+Next-Generation+Sequencing+in+Patients+With+Lung+Cancer:+A+Quality+Improvement+Study+at+Dartmouth-Hitchcock+Medical+Center.">Improving Adequacy of Small Biopsy and Fine-Needle Aspiration Specimens for Molecular Testing by Next-Generation Sequencing in Patients With Lung Cancer: A Quality Improvement Study at Dartmouth-Hitchcock Medical Center.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 141 (3), 402-409 (2017).</li><li>Tsao, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IASLC ATLAS of PD-L1 Immunohistochemistry Testing in Lung Cancer. , (2017).</li><li>Thunnissen, E., de Langen, A. J., Smit, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+IHC+in+NSCLC+with+a+global+and+methodological+perspective.">PD-L1 IHC in NSCLC with a global and methodological perspective.</a> Lung Cancer. , 102-105 (2017).</li><li>Ilie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+22C3+anti-PD-L1+antibody+to+determine+PD-L1+expression+in+multiple+automated+immunohistochemistry+platforms.">Use of the 22C3 anti-PD-L1 antibody to determine PD-L1 expression in multiple automated immunohistochemistry platforms.</a> PLoS One. 12 (8), e0183023 (2017).</li><li>Ilie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+22C3+anti-programmed+death+ligand+1+antibody+to+determine+programmed+death+ligand+1+expression+in+cytology+samples+obtained+from+non-small+cell+lung+cancer+patients.">Use of the 22C3 anti-programmed death ligand 1 antibody to determine programmed death ligand 1 expression in cytology samples obtained from non-small cell lung cancer patients.</a> Cancer Cytopathology. 126 (4), 264-274 (2018).</li><li>Skov, B. G., Skov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+Comparison+of+PD-L1+Expression+on+Cytologic+and+Histologic+Specimens+From+Malignancies+in+the+Lung+Assessed+With+PD-L1+IHC+28-8pharmDx+and+PD-L1+IHC+22C3pharmDx.">Paired Comparison of PD-L1 Expression on Cytologic and Histologic Specimens From Malignancies in the Lung Assessed With PD-L1 IHC 28-8pharmDx and PD-L1 IHC 22C3pharmDx.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 25 (7), 453-459 (2017).</li><li>Russell-Goldman, E., Kravets, S., Dahlberg, S. E., Sholl, L. M., Vivero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytologic-histologic+correlation+of+programmed+death-ligand+1+immunohistochemistry+in+lung+carcinomas.">Cytologic-histologic correlation of programmed death-ligand 1 immunohistochemistry in lung carcinomas.</a> Cancer Cytopathology. 126 (4), 253-263 (2018).</li><li>Heymann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+non-small+cell+lung+carcinoma:+Comparison+among+cytology,+small+biopsy,+and+surgical+resection+specimens.">PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens.</a> Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).</li><li>Stoy, S. P., Rosen, L., Mueller, J., Murgu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-ligand+1+testing+of+lung+cancer+cytology+specimens+obtained+with+bronchoscopy.">Programmed death-ligand 1 testing of lung cancer cytology specimens obtained with bronchoscopy.</a> Cancer Cytopathology. 126 (2), 122-128 (2018).</li><li>Ilie, M., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+PD-L1+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer-know+your+limits+but+never+stop+trying+to+exceed+them.">Reproducibility of PD-L1 assessment in non-small cell lung cancer-know your limits but never stop trying to exceed them.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (Suppl 1), S51-S54 (2017).</li></ol>

Abbiamo convalidato un LDT ottimizzata utilizzando il concentrato di anticorpo del PD-L1 22 3, attraverso il confronto con il corrispondente test commerciale clinicamente validato10,11. 3 22 concentrato anticorpo-basato LDT ha mostrato un alto tasso di concordanza tra biopsia (~ 100%) e campioni di citologia (~ 95%) quando confrontata con l'espressione di PD-L1 IHC valutata mediante il saggio di PD-L1 IHC 3 22 a ≥ 1% TPS sia il ≥ 50% TPS taglio punti. Come re...

Recenti studi clinici hanno dimostrato l'efficacia di pembrolizumab, un anticorpo di isotipo monoclonale umanizzato di kappa IgG4 che blocca l'interazione tra la morte programmata delle cellule 1 (PD-1) ed i suoi ligandi, PD-L1 e L2-PD, nel trattamento di pazienti con avanzato NSCLC1,2,3,4.
Attualmente, pembrolizumab è approvato per il trattamento di NSCLC PD-L1-esprimendo in entrambi i pazienti naïve al trattamento con un'espressione di PD-L1 TPS di ≥ 50% e nessun recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) o aberrazioni di linfoma anaplastic della chinasi (ALK) tumore genomico3 e per precedentemente trattati pazienti con un TPS PD-L1 di ≥ 1%1.
PD-L1 espressione proteica rilevata da IHC è stato ampiamente usato come analisi predittiva biomarcatore per terapie anti-PD-1/PD-L1. Negli studi clinici di pembrolizumab, il PD-L1 TPS ottenuti con formalina di campioni di tessuto paraffina (FFPE) è stato determinato utilizzando il PD-L1 IHC 3 22 compagno test5. Questo test è stato approvato da la US Food and Drug Administration (FDA) ed è stato marcato CE in Europa per la determinazione del tumore PD-L1 TPS5.
Ulteriori opzioni globali attraverso istituzioni per valutazioni affidabili e di alta qualità del TPS PD-L1 con LDTs che usare il concentrato di 22 3 anticorpo sono essenziali per sostenere le decisioni cliniche in materia di ammissibilità paziente per pembrolizumab trattamento. Un gran numero di laboratori di patologia non hanno accesso per il dosaggio di PD-L1 IHC 22 3 diagnostico compagno. Di conseguenza, lo sviluppo di affidabili e coerenti LDTs compatibile con piattaforme IHC autostainer ulteriori, ampiamente disponibili è essenziale.
Inoltre, c'è la necessità di stabilire LDTs usando campioni di citologia che sono il tipo di unico esemplare frequentemente disponibile da pazienti con NSCLC. Il dosaggio di compagno PD-L1 IHC 3 22 è convalidato per le resezioni, biopsie dell'ago e broncoscopie solo se la broncoscopia produce 100 cellule del tumore. Anche se spesso si ottengono i suddetti tipi di campione, campioni di citologia sono più facilmente raccolti e sono il tipo di campione più comunemente disponibile in alcune istituzioni6,7. Tuttavia, non c'è attualmente nessun test diagnostico convalidato disponibile per la valutazione dell'espressione PD-L1 in campioni di citologia; affidabile LDTs compatibile con campioni di citologia faciliterebbe ulteriori test di alta qualità PD-L1.
Inoltre, quando si stabilisce la validazione clinica di un LDT, l'IHC deve essere eseguita in modo simile ai test commerciale clinicamente validato corrispondente8. Per esempio, diversi passaggi critici devono essere verificate per ottenere lo stesso segnale in sezioni seriali quali titolazione di anticorpi, pretrattamento ritardi, tempi di incubazione e di sistemi di amplificazione9.
Recentemente abbiamo sviluppato un LDT ottimizzato che utilizza il concentrato 22 3 anticorpo per valutare l'espressione di PD-L1 su biopsie del tumore e citologia campioni10,11. Abbiamo trovato un'alta concordanza con la LDT contro il "gold standard" PD-L1 IHC 22 3 analisi10,11. Questo protocollo clinicamente validato sosterrà affidabile, di alta qualità PD-L1 test tra le regioni a livello mondiale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NovaPrep HQ1</td>
			<td>Novacyt</td>
			<td>NA</td>
			<td>Preservative solution for cytology specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaprep&#174; HQ+ B</td>
			<td>Novacyt</td>
			<td>NA</td>
			<td>Mucolytic solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek VIP 6</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6042 VIP 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>5229 TEC 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope glass slide SuperFrost Plus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4951PLUS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Multi Reax Vortex Shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-889-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cytoblock</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7401150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>#M365329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-L1 IHC 22C3 pharmDx</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>SK006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autostainer Link 48</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>AS480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark ULTRA autostainer</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView HQ Universal Linker</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView HRP Multimer</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Amplification H2O2</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Amplifier</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Amplification Multimer</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView DAB</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Copper</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin II</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#790-2208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluing Reagent</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-2037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Conditioning 1 (CC1)</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#950-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Film Coverslipper</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4742</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using 22c3 anti-pd-l1 antibody concentrate on biopsy and cytology samples from non-small cell lung cancer patients

Pembrolizumab in monoterapia è stato approvato per il trattamento di prima e seconda linea di pazienti con PD-L1-esprimendo avanzata di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). Test per PD-L1 espressione con l'analisi diagnostica di PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22 3 compagno, che dà una percentuale di tumore Punteggio ottenuto (TPS), è stato convalidato il tessuto del tumore. Abbiamo sviluppato un test ottimizzato laboratorio-sviluppato (LDT) che utilizza il concentrato 22 3 anticorpo (Ab) su un autostainer IHC ampiamente disponibile per gli esemplari di biopsia e citologia. Il TPS PD-L1 è stato valutato con 120 sezioni di accoppiati insieme-tumore del tessuto e i campioni di biopsia e con 70 accoppiato i campioni di biopsia e citologia (lavaggi bronchiali, n = 40; le effusioni pleuriche, n = 30). Il 22 3 Ab che concentrato a base di LDT ha mostrato un alto tasso di concordanza tra biopsia (~ 100%) e citologia (~ 95%) esemplari quando confrontata con IHC PD-L1 espressione valutata mediante il saggio di 22 3 compagno IHC PD-L1 a entrambi TPS taglio punti (≥ 1%, ≥ 50%). LDT ottimizzato presentato qui, usando il concentrato di Ab 22 3 per determinare l'espressione di PD-L1 in entrambi il tessuto del tumore e in campioni citologici, si espanderà la capacità dei laboratori in tutto il mondo per valutare l'ammissibilità dei pazienti con NSCLC trattati con pembrolizumab in monoterapia in modo affidabile e riproducibile.

Utilizzando la procedura presentata qui e come descritto in dettaglio in recenti pubblicazioni10,11 di questo gruppo, LDT ottimizzato è stato clinicamente validato con 120 campioni di biopsia FFPE NSCLC archivistici da pazienti sottoposti a chirurgia resezione o una biopsia presso l'ospedale universitario di Pasteur, Nizza, tra marzo 2007 e marzo 2016. Inoltre, per la valutazione dell'espressione di PD-L1 dei campioni di citologi...

Watch this Scientific Journal Video about Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients at JoVE.com

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Utilizzando 22 3 dell'anticorpo Anti-PD-L1 concentrarsi sulla biopsia e campioni di citologia dai malati di cancro del polmone Non a piccole cellule

Per espandere la capacità dei laboratori in tutto il mondo per valutare l'ammissibilità dei pazienti con cancro del polmone per il trattamento con pembrolizumab, in modo affidabile e riproducibile, abbiamo sviluppato un test che utilizza il 22 3 anticorpo concentrato su un ampiamente disponibile immunohistochemical autostainer, per gli esemplari di biopsia e la citologia.

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Questo metodo che utilizza il concentrato di anticorpi 22C3 per determinare l'espressione di PD-L1 sia nel tessuto tumorale che nel campione di citologia amplierà la capacità dei laboratori di valutare la selezione di pazienti con cancro polmonare a cellule non piccole per l'immunoterapia in modo affidabile e riproducibile. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è altamente concorde con il saggio gold standard e supporterà test PD-L1 affidabili e di alta qualità in tutte le regioni del mondo. In generale, i patologi nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa della colorazione granulare osservata occasionalmente.Inoltre, la colorazione delle cellule umane è un po 'più intensa di quella osservata con il gold standard. Pertanto la formazione dei patologi è necessaria per ottenere una corretta interpretazione della colorazione PD-L1 con il 22C3 LDT. A dimostrare la procedura sarà la signoraMarame Hamila, una tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, fissare il tessuto tumorale in formalina tamponata al 10% in una cassetta e incorporare la cassetta in paraffina come delineato nel protocollo di testo. Incorporare il tessuto infiltrato all'interno di uno stampo riempito con paraffina fusa.Lasciare che il tessuto rimanga nello stampo fino a quando la paraffina non si è solidificata. Successivamente, utilizzare un microtomo per sessare il tessuto incorporato nella paraffina a uno spessore di tre micrometri. Trasferire il nastro di paraffina su uno scivolo al microscopio in vetro caricato positivamente.Quindi, asciugare lo scivolo per un'ora a 37 gradi Celsius. In primo luogo, raccogliere i lavaggi bronchiali in una soluzione conservante. Trasferire i lavaggi in un tubo conico da 50 millilitri.Aggiungere due grammi di DL-Ditiothreitol e vortice il tubo per 30 minuti, quindi centrifugare a 250 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante e aggiungere 10 millilitri di una soluzione mucolitica. Agitare il campione a media velocità per 20 minuti e centrifugare a 250 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente.Successivamente, rimuovere il supernatante e depositare il pellet cellulare in un tubo di raccolta contenente formalina tamponata al 10% neutra. Aggiungere quattro gocce di un agente di preparazione del blocco cellulare. Trasferire il pellet di cella su una cassetta.Fissare il pellet cellulare per l'incorporamento e la sessatura della paraffina utilizzando il processo precedentemente descritto per la preparazione di campioni di tessuto tumorale. Per iniziare, accensione dell'autostainer e del computer. Fare doppio clic sull'icona del rilevamento automatico e scegliere l'utente.Fare clic su Crea etichetta e quindi su Protocollo. Fare doppio clic sul protocollo 22C3. Compilare l'ID del paziente e fare clic su Stampa.Successivamente, attaccare l'etichetta sulla diapositiva. Premere il pulsante sul cassetto diapositiva scelto per aprirlo e posizionare la diapositiva etichettata sul pad termico con l'etichetta rivolta verso l'alto e verso l'interno. Chiudere il cassetto scorrevole.Quindi, rimuovere i tappi dai distributori. Caricare i reagenti sul rack dei reagenti. Aprire il cofano della scala e posizionare i rack dei reagenti sulla giostra dei reagenti, assicurandosi che si adattino correttamente e si tengano in posizione, quindi chiudere il cofano.Nel software, fare clic sullo strumento che verrà utilizzato e quindi fare clic su In esecuzione. Al termine della procedura IHC, utilizzare l'acqua del rubinetto con una singola goccia di soluzione detergente per risciacquare il vetrino per diversi secondi. Disidratare lo scivolo immergendolo in sequenza in due bagni di etanolo per diversi secondi ciascuno, quindi posizionare lo scivolo in una macchina di copertura per caricare automaticamente lo slittamento del coperchio.Per iniziare a valutare la qualità della colorazione PD-L1, analizzare i controlli positivi e negativi prima di esaminare il campione del paziente. Utilizzando un microscopio, confermare la presenza di almeno 100 cellule tumorali vitali. Con un basso ingrandimento di 4 volte, valuta tutte le aree tumorali positive e negative ben conservate.Successivamente, segnare la colorazione parziale o completa della membrana cellulare e calcolare il punteggio della proporzione tumorale valutando la proporzione di cellule tumorali PD-L1 positive rispetto a tutte le cellule tumorali presenti nelle aree tumorali ben conservate. In questo studio, il punteggio di proporzione tumorale o TPS viene valutato per campioni di biopsia dei tessuti accoppiati in blocchi di cellule preparati da lavaggi bronchiali o effusioni pleuriche. I modelli di colorazione rappresentativi con campioni di biopsia vengono utilizzati per confrontare il concentrato di anticorpi 22C3 con il saggio complementare PD-L1 IHC 22C3.Il coefficiente di correlazione intraclasse, che viene utilizzato per misurare la correlazione del punteggio TPS come variabile continua, è del 99% tra l'LDT e il gold standard. Modelli di colorazione rappresentativi con campioni di citologia vengono utilizzati anche per confrontare il concentrato di anticorpi 22C3 con il saggio complementare PD-L1 IHC 22C3. Il tasso di concordanza dei campioni di biopsia e citologia con l'LDT è superiore al 95% quando si utilizza uno dei punti di taglio TPS.Il coefficiente di correlazione intraclasse durante l'utilizzo di TPS come variabile continua è compreso tra 0,88 e 0,90. Una volta padroneggiata, questa tecnica dà un alto tasso di concordanza con il gold standard nel valutare il cutoff per positività o istologia tumorale sia per i campioni di tessuto che per i ciclici. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i campioni devono essere valutati con riferimento alla diapositiva HE e in alcuni casi difficili possono essere eseguite macchie complementari per valutare le cellule immunitarie per escludere un'interpretazione errata dell'espressione PD-L1 solo nelle cellule tumorali.Seguendo questa procedura, è possibile valutare altri campioni come biopsie ad ago fine, EUS-FNA o spazzole bronchiali. Dopo la sua impostazione nelle cliniche, la robustezza del saggio deve essere mantenuta nel tempo cercando l'accreditamento, seguendo procedure operative standard e partecipando regolarmente a schemi esterni di valutazione della qualità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come implementare il protocollo ottimizzato utilizzando l'anticorpo anti-PD-L1 22C3 concentrato su un autostainer IHC ampiamente disponibile sia campioni di biopsia che di citologia da pazienti con cancro polmonare a cellule non piccole.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Analisi di reclutamento delle cellule di tumore del polmone

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

MicroRNA biopsia liquida di base: L'esperienza del Plasma quieto firma classificatore (MSC) per lo Screening del cancro del polmone

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Metodo semplice e veloce per ottenere alta qualità tumore del DNA da campioni clinico-patologiche utilizzando Touch Imprint citologia

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Colorazione elastica su vetrini di tessuto gastrico pT3N0M0 gastrico

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

Analisi di invasione della cellula tumorale e anti-metastatica utilizzando Hydrogel Micro-camera matrice (HMCA) di Screening di stupefacenti-piastre di base

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Caratterizzazione semiautomatica PD-L1 ed enumerazione delle cellule tumorali circolanti da pazienti affetti da cancro del polmone a cellule non piccole mediante immunofluorescenza

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radiosensibilità delle cellule staminali tumorali nelle linee cellulari del cancro del polmone

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Rilevamento di DNA privo di cellule in campioni di plasma sanguigno di pazienti oncologici

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolamento e valutazione funzionale di cellule staminali di cancro al seno umano da campioni di cellule e tessuti

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...