Name: using 22c3 anti-pd-l1 antibody concentrate on biopsy and cytology samples from non-small cell lung cancer patients
Uploaded: 2018-09-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients at JoVE.com

Este estudo foi patrocinado pela Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. Os financiadores não desempenharam nenhum papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética local (Comitê de ética de pesquisa humana, Centre Hospitalier Universitaire de Nice/Tumorothèque BB-0033-00025).
Nota: Este protocolo é ajustado especificamente para o uso do anticorpo 22 3 concentrado em um stainer IHC automatizado disponível comercialmente (referido como autostainer aqui, consulte a Tabela de materiais) para amostras de citologia e biópsias de tumor.
1. preparação...

<ol>
	<li>Garon, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+for+the+treatment+of+non-small-cell+lung+cancer.">Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (21), 2018-2028 (2015).</li><li>Herbst, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboplatin+and+pemetrexed+with+or+without+pembrolizumab+for+advanced,+non-squamous+non-small-cell+lung+cancer:+a+randomised,+phase+2+cohort+of+the+open-label+KEYNOTE-021+study.">Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study.</a> The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).</li><li>Buttner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Death-Ligand+1+Immunohistochemistry+Testing:+A+Review+of+Analytical+Assays+and+Clinical+Implementation+in+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).</li><li>Folch, E., Costa, D. B., Wright, J., VanderLaan, P. 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G., Skov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+Comparison+of+PD-L1+Expression+on+Cytologic+and+Histologic+Specimens+From+Malignancies+in+the+Lung+Assessed+With+PD-L1+IHC+28-8pharmDx+and+PD-L1+IHC+22C3pharmDx.">Paired Comparison of PD-L1 Expression on Cytologic and Histologic Specimens From Malignancies in the Lung Assessed With PD-L1 IHC 28-8pharmDx and PD-L1 IHC 22C3pharmDx.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 25 (7), 453-459 (2017).</li><li>Russell-Goldman, E., Kravets, S., Dahlberg, S. E., Sholl, L. M., Vivero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytologic-histologic+correlation+of+programmed+death-ligand+1+immunohistochemistry+in+lung+carcinomas.">Cytologic-histologic correlation of programmed death-ligand 1 immunohistochemistry in lung carcinomas.</a> Cancer Cytopathology. 126 (4), 253-263 (2018).</li><li>Heymann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+non-small+cell+lung+carcinoma:+Comparison+among+cytology,+small+biopsy,+and+surgical+resection+specimens.">PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens.</a> Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).</li><li>Stoy, S. P., Rosen, L., Mueller, J., Murgu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-ligand+1+testing+of+lung+cancer+cytology+specimens+obtained+with+bronchoscopy.">Programmed death-ligand 1 testing of lung cancer cytology specimens obtained with bronchoscopy.</a> Cancer Cytopathology. 126 (2), 122-128 (2018).</li><li>Ilie, M., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+PD-L1+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer-know+your+limits+but+never+stop+trying+to+exceed+them.">Reproducibility of PD-L1 assessment in non-small cell lung cancer-know your limits but never stop trying to exceed them.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (Suppl 1), S51-S54 (2017).</li></ol>

Podemos ter validado uma LDT otimizada usando o concentrado de anticorpo 22 3 PD-L1, comparando-a com o correspondente clinicamente validado teste comercial10,11. 3 a 22 concentrado LDT baseados em anticorpo que mostrou uma alta taxa de concordância entre a biópsia (~ 100%) e amostras de citologia (~ 95%) quando comparado com a expressão de IHC PD-L1 determinada usando o ensaio de IHC PD-L1 22 3 ≥ 1% TPS e o ≥ 50% TPS cortar pontos. Como recentemente recom...

Ensaios clínicos recentes têm demonstrado a eficácia do pembrolizumab, um humanizado IgG4 kappa isotipo anticorpo monoclonal que bloqueia a interação entre a morte celular programada 1 (PD-1) e seus ligantes, PD-L1 e L2-PD, no tratamento de pacientes com avançado NSCLC1,2,3,4.
Atualmente, pembrolizumab é aprovado para tratamento de NSCLC PD-L1-expressando em ambos os pacientes tratamento-ingénuos com uma expressão de PD-L1 TPS de ≥ 50% e nenhum receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) ou linfoma anaplásico quinase (ALK) tumor genômica de aberrações cromossómicas3 e para previamente tratados pacientes com um TPS-PD-L1 de ≥ 1%1.
Expressão de proteínas de PD-L1 detectado pelo IHC foi amplamente utilizado como um ensaio de biomarcador preditiva das terapias anti-PD-1/PD-L1. Em ensaios clínicos pembrolizumab, PD-L1 TPS obtidos com fixada em formol amostras de tecido (FFPE) parafina foi determinada utilizando o companheiro de IHC PD-L1 22 3 ensaio5. Este ensaio foi aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) e tem sido a marcação CE na Europa para a determinação do tumor PD-L1 TPS5.
Opções globais adicionais através de instituições para avaliações confiáveis e de alta qualidade da PD-L1 TPS com LDTs que usam o concentrado anticorpo 22 3 são essenciais para apoiar as decisões clínicas feitas a respeito da elegibilidade de pacientes para pembrolizumab tratamento. Um grande número de laboratórios de patologia não tem acesso para o ensaio de IHC PD-L1 22 3 diagnóstico complementar. Portanto, é essencial o desenvolvimento de confiáveis e consistentes LDTs compatíveis com plataformas de autostainer IHC adicionais, amplamente disponíveis.
Além disso, há uma necessidade de estabelecer LDTs usando amostras de citologia que são o único espécime tipo frequentemente disponível a partir de pacientes NSCLC. O ensaio de companheiro de IHC PD-L1 22 3 é validado para ressecções, biopsias de agulha e broncofibroscopias somente se a broncoscopia produz 100 células de tumor. Embora os tipos de amostra acima são frequentemente obtidos, amostras de citologia são mais facilmente coletadas e são o tipo de amostra mais comumente disponíveis em algumas instituições6,7. No entanto, não há atualmente nenhum ensaio validado de diagnóstico disponíveis para a avaliação da expressão PD-L1 em amostras de citologia; LDTs confiáveis compatíveis com amostras de citologia iria facilitar ainda mais o teste de PD-L1 de alta qualidade.
Além disso, ao estabelecer a validação clínica de uma LDT, o IHC deve ser realizada de forma semelhante ao correspondente clinicamente validado teste comercial8. Por exemplo, várias etapas críticas devem ser verificadas para obter o mesmo sinal em seções seriais como titulação de anticorpos, atrasos de pré-tratamento, tempo de incubação e de sistemas de amplificação9.
Recentemente desenvolvemos uma LDT otimizada que usa o concentrado de 22 3 anticorpo para avaliar a expressão de PD-L1 no tumor biópsias e citologia amostras10,11. Encontramos uma alta concordância com a LDT contra o "padrão ouro" PD-L1 IHC 22 3 ensaio10,11. Este protocolo clinicamente validado oferecerá suporte confiável e de alta qualidade PD-L1 testes globalmente em todas as regiões.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NovaPrep HQ1</td>
			<td>Novacyt</td>
			<td>NA</td>
			<td>Preservative solution for cytology specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaprep&#174; HQ+ B</td>
			<td>Novacyt</td>
			<td>NA</td>
			<td>Mucolytic solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek VIP 6</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6042 VIP 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>5229 TEC 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope glass slide SuperFrost Plus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4951PLUS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Multi Reax Vortex Shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-889-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cytoblock</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7401150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>#M365329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-L1 IHC 22C3 pharmDx</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>SK006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autostainer Link 48</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>AS480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark ULTRA autostainer</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView HQ Universal Linker</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView HRP Multimer</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Amplification H2O2</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Amplifier</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Amplification Multimer</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView DAB</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Copper</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin II</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#790-2208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluing Reagent</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-2037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Conditioning 1 (CC1)</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#950-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Film Coverslipper</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4742</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using 22c3 anti-pd-l1 antibody concentrate on biopsy and cytology samples from non-small cell lung cancer patients

Pembrolizumab em monoterapia foi aprovado para o tratamento de primeira e segunda linha de pacientes com PD-L1-expressando avançado câncer de pulmão não-pequenas células (NSCLC). Ensaios de expressão PD-L1 com o ensaio diagnóstico complementar de 22 3 PD-L1 imuno-histoquímica (IHC), o que dá uma proporção de tumor partitura (TPS), foi validada no tecido do tumor. Desenvolvemos um otimizado desenvolvido laboratório teste (LDT) que usa o concentrado de 22 3 anticorpo (Ab) em um autostainer IHC amplamente disponível para espécimes de biópsia e citologia. O TPS-PD-L1 foi avaliada com 120 seções emparelhados todo-tumor de tecido e amostras de biópsia e com 70 combinado amostras de biópsia e citologia (lavagens brônquicas, n = 40; derrame pleural, n = 30). O Ab 22 3 que baseado em concentrado LDT mostrou uma alta taxa de concordância entre a biópsia (~ 100%) e citologia espécimes (~ 95%) quando comparado com a expressão de IHC PD-L1 determinado usando o ensaio de 22 3 companheiro de IHC PD-L1 em ambos os TPS corta pontos (≥ 1%, ≥ 50%). A LDT otimizada apresentada aqui, usando o concentrado de Ab 22 3 para determinar a expressão de PD-L1 em ambos os tecidos de tumor e em amostras de citologia, vai expandir a capacidade dos laboratórios em todo o mundo para avaliar a elegibilidade de pacientes com NSCLC para tratamento com pembrolizumab em monoterapia de forma confiável e reprodutível.

Usando o procedimento apresentado aqui e conforme descrito em detalhes no recentes publicações10,11 deste grupo, LDT otimizado foi clinicamente validado com 120 amostras de biópsia FFPE NSCLC arquivamento de pacientes submetidos à cirurgia ressecção ou uma biópsia no Hospital Universitário Pasteur, Nice, entre março de 2007 e março de 2016. Além disso, para a avaliação da expressão de PD-L1 de amostras de citologia, ...

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Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Usando 22 3 anticorpo Anti-PD-L1 concentrar-se na biópsia e citologia amostras de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células

Para expandir a capacidade dos laboratórios em todo o mundo para avaliar a elegibilidade de pacientes com câncer de pulmão para tratamento com pembrolizumab, de forma confiável e reproduzível, nós desenvolvemos um ensaio que usa o concentrado de 22 3 anticorpo em um amplamente disponível imuno-histoquímica autostainer, para amostras tanto biópsia e citologia.

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Este método utilizando o concentrado de anticorpos 22C3 para determinar a expressão PD-L1 tanto no tecido tumoral quanto na citologia expandirá a capacidade dos laboratórios de avaliar a seleção de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas para imunoterapia de forma confiável e reprodutível. A principal vantagem desta técnica é que ela é altamente concordante com o ensaio padrão-ouro e suportará testes PD-L1 confiáveis e de alta qualidade em todas as regiões do mundo. Em geral, os patologistas novos neste método lutarão por causa da coloração granular ocasionalmente observada.Além disso, a coloração das células humanas é um pouco mais intensa do que a observada com o padrão-ouro. Portanto, a formação de patologistas é necessária para obter a interpretação correta da coloração PD-L1 com o LDT 22C3. Demonstrando o procedimento será a Sra.Marame Hamila, um técnico do meu laboratório. Para começar, fixe o tecido tumoral em formalina tamponada 10% neutra em uma fita e incorpore a fita em parafina conforme descrito no protocolo de texto. Incorpore o tecido infiltrado dentro de um molde cheio de parafina derretida.Deixe o tecido ficar no molde até que a parafina se solidifique. Depois disso, use um microtome para secionar o tecido embutido na parafina em uma espessura de três micrômetros. Transfira a fita de parafina para um slide de microscópio de vidro carregado positivamente.Em seguida, seque o escorregador por uma hora a 37 graus Celsius. Primeiro, recolher as lavagens brônquias em uma solução conservante. Transfira as lavagens para um tubo cônico de 50 mililitros.Adicione dois gramas de DL-Dithiothreitol e vórtice do tubo por 30 minutos, depois centrífuga a 250 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente. Remova o supernatante e adicione 10 mililitros de uma solução mucóltica. Agite a amostra em velocidade média por 20 minutos e centrífugue a 250 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente.Depois disso, remova o supernatante e deposite a pelota da célula em um tubo de coleta contendo formalina 10% neutra. Adicione quatro gotas de um agente de preparação de blocos de células. Transfira a cápsula da célula para uma fita.Fixar a pelota celular para incorporação e secção de parafinas usando o processo descrito anteriormente para o preparo de amostras de tecido tumoral. Para começar, ligue o auto-tainer e o computador. Clique duas vezes no ícone de auto-tainer e escolha o usuário.Clique em Criar rótulo e, em seguida, em Protocolo. Clique duas vezes no protocolo 22C3. Preencha a ID do paciente e clique em Imprimir.Depois disso, coloque a etiqueta no slide. Pressione o botão na gaveta de slides escolhida para abri-lo e coloque o slide rotulado na almofada térmica com a etiqueta voltada para cima e para dentro. Feche a gaveta de slides.Em seguida, remova as tampas dos distribuidores. Carregue os reagentes no rack de reagentes. Abra o capô do manchador e coloque os racks de reagente no carrossel de reagentes, certificando-se de que eles se encaixam corretamente e mantenham a posição, em seguida, feche o capô.No software, clique no instrumento que será usado e clique em Executar. No final do procedimento IHC, use água da torneira com uma única gota de solução de limpeza para enxaguar o slide por vários segundos. Desidrate o slide, imergindo-o sequencialmente em dois banhos de etanol por vários segundos cada, em seguida, coloque o slide em uma máquina de cobertura para carregar automaticamente o deslizamento da tampa.Para começar a avaliar a qualidade da coloração PD-L1, analise os controles positivos e negativos antes de examinar a amostra do paciente. Usando um microscópio, confirme a presença de pelo menos 100 células tumorais viáveis. Com baixa ampliação de 4 vezes, avalie todas as áreas tumorais positivas e negativas bem preservadas.Depois disso, escore a coloração parcial ou completa da membrana celular e calcule o escore de proporção do tumor avaliando a proporção de células tumorais PD-L1 positivos em relação a todas as células tumorais presentes nas áreas tumorais bem preservadas. Neste estudo, o escore de proporção do tumor ou TPS é avaliado para amostras de biópsia de tecido pareado em blocos de células preparados a partir de lavagens brônquicas ou derrames pleurais. Padrões representativos de coloração com amostras de biópsia são usados para comparar o concentrado de anticorpos 22C3 com o ensaio companheiro PD-L1 IHC 22C3.O coeficiente de correlação intraclasse, utilizado para medir a correlação do escore TPS como variável contínua, é de 99% entre o LDT e o padrão-ouro. Padrões representativos de coloração com amostras de citologia também são usados para comparar o concentrado de anticorpos 22C3 com o ensaio companheiro PD-L1 IHC 22C3. A taxa de concordância das amostras de biópsia e citologia com o LDT é superior a 95% ao usar qualquer um dos pontos de corte do TPS.O coeficiente de correlação intraclasse, utilizando O TPS como variável contínua, está entre 0,88 e 0,90. Uma vez dominada, esta técnica dá uma alta taxa de concordância com o padrão-ouro na avaliação do corte para positividade ou histologia tumoral para espécimes de tecido e citologia. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as amostras devem ser avaliadas com referência ao slide he e, em alguns casos difíceis, manchas complementares para avaliar células imunes podem ser realizadas para excluir a má interpretação da expressão PD-L1 apenas em células tumorais.Após este procedimento, outras amostras como biópsias de agulha fina, EUS-FNAs ou escovas brônquicas podem ser avaliadas. Após sua fixação nas clínicas, a robustez do ensaio precisa ser mantida ao longo do tempo, buscando credenciamento, seguindo procedimentos operacionais padrão e participando regularmente de esquemas externos de avaliação da qualidade. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como implementar o protocolo otimizado usando o anticorpo anti-PD-L1 22C3 concentrado em um autostainer IHC amplamente disponível, tanto amostras de biópsia quanto de citologia de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Coloração elástica em lâminas de parafina-Embedded de pT3N0M0 tecido de câncer gástrico

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Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

Análise de invasão de células de câncer e usando a matriz de hidrogel Microcâmara (HMCA) de despistagem de drogas antimetastática-baseado placas

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Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

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