Name: using 22c3 anti-pd-l1 antibody concentrate on biopsy and cytology samples from non-small cell lung cancer patients
Uploaded: 2018-09-25T15:00:00
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Este estudio fue patrocinado por Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. Los patrocinadores no desempeñó ningún papel en el diseño del estudio recolección de datos y análisis, publicación y preparación del manuscrito.

Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité de ética local (Comité de ética de investigación humana, Centre Hospitalier Universitaire de Niza/Tumorothèque BB-0033-00025).
Nota: Este protocolo está ajustado específicamente para el uso del concentrado 22 3 anticuerpo en un stainer IHC automatizado disponible en el mercado (conocido como autostainer aquí, ver la Tabla de materiales) para muestras de citología y biopsias del tumor.
<p class="jove_title"...

<ol>
	<li>Garon, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+for+the+treatment+of+non-small-cell+lung+cancer.">Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (21), 2018-2028 (2015).</li><li>Herbst, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboplatin+and+pemetrexed+with+or+without+pembrolizumab+for+advanced,+non-squamous+non-small-cell+lung+cancer:+a+randomised,+phase+2+cohort+of+the+open-label+KEYNOTE-021+study.">Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study.</a> The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).</li><li>Buttner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Death-Ligand+1+Immunohistochemistry+Testing:+A+Review+of+Analytical+Assays+and+Clinical+Implementation+in+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).</li><li>Folch, E., Costa, D. 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G., Skov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+Comparison+of+PD-L1+Expression+on+Cytologic+and+Histologic+Specimens+From+Malignancies+in+the+Lung+Assessed+With+PD-L1+IHC+28-8pharmDx+and+PD-L1+IHC+22C3pharmDx.">Paired Comparison of PD-L1 Expression on Cytologic and Histologic Specimens From Malignancies in the Lung Assessed With PD-L1 IHC 28-8pharmDx and PD-L1 IHC 22C3pharmDx.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 25 (7), 453-459 (2017).</li><li>Russell-Goldman, E., Kravets, S., Dahlberg, S. E., Sholl, L. M., Vivero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytologic-histologic+correlation+of+programmed+death-ligand+1+immunohistochemistry+in+lung+carcinomas.">Cytologic-histologic correlation of programmed death-ligand 1 immunohistochemistry in lung carcinomas.</a> Cancer Cytopathology. 126 (4), 253-263 (2018).</li><li>Heymann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+non-small+cell+lung+carcinoma:+Comparison+among+cytology,+small+biopsy,+and+surgical+resection+specimens.">PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens.</a> Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).</li><li>Stoy, S. P., Rosen, L., Mueller, J., Murgu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-ligand+1+testing+of+lung+cancer+cytology+specimens+obtained+with+bronchoscopy.">Programmed death-ligand 1 testing of lung cancer cytology specimens obtained with bronchoscopy.</a> Cancer Cytopathology. 126 (2), 122-128 (2018).</li><li>Ilie, M., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+PD-L1+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer-know+your+limits+but+never+stop+trying+to+exceed+them.">Reproducibility of PD-L1 assessment in non-small cell lung cancer-know your limits but never stop trying to exceed them.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (Suppl 1), S51-S54 (2017).</li></ol>

Hemos validado una LDT optimizado usando el concentrado de anticuerpo 22 3 PD-L1, comparando con el validados clínicamente prueba comercial correspondiente10,11. 3 22 concentrados basados en anticuerpos LDT mostró una alta tasa de concordancia entre (~ 100%) la biopsia y muestras citológicas (~ 95%) en comparación con la expresión de PD-L1 IHC determinada usando el análisis de PD-L1 IHC 3 de 22 en ≥1% TPS y el ≥50% TPS puntos de corte. Como recientement...

Recientes ensayos clínicos han demostrado la eficacia de la pembrolizumab, un humanizado IgG4 kappa isotipo anticuerpo monoclonal que bloquea la interacción entre la muerte celular programada 1 (PD-1) y sus ligandos, PD-L1 y PD-L2, en el tratamiento de pacientes con 2,1,de avanzado NSCLC del3,4.
Actualmente, pembrolizumab está aprobada para el tratamiento de NSCLC PD-L1-expresión en ambos pacientes de tratamiento con una expresión de PD-L1 TPS de ≥50% y no del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o aberraciones de genomic tumor linfoma anaplásico kinasa (ALK)3 y para previamente tratado a pacientes con un TPS de PD-L1 de ≥1%1.
PD-L1 expresión de la proteína detectada por IHC ha sido ampliamente utilizada como un ensayo de biomarcadores predictivos para las terapias anti-PD-1/PD-L1. En ensayos clínicos de pembrolizumab, el TPS de PD-L1 obtenidos con muestras de tejido de formalina-fijo de parafina-encajado (FFPE) se determinó utilizando la PD-L1 IHC 3 22 compañero ensayo5. Este ensayo ha sido aprobado por la US Food y Drug Administration (FDA) y ha marcado CE en Europa para la determinación del tumor TPS PD-L15.
Adicionales opciones globales a través de las instituciones para las evaluaciones confiables y de alta calidad de los TPS de PD-L1 con LDTs que utilizan el concentrado 22 3 anticuerpo son esenciales para apoyar las decisiones clínicas sobre paciente elegibilidad para pembrolizumab tratamiento. Un gran número de laboratorios de patología no tienen acceso al ensayo de PD-L1 IHC 3 22 diagnóstico de compañero. Por lo tanto, es esencial el desarrollo de LDTs confiables y coherentes compatibles con plataformas de reactivos autostainer IHC adicionales, ampliamente disponibles.
Por otra parte, es necesario establecer LDTs utilizando muestras citológicas que son el tipo de muestra sólo disponible con frecuencia en pacientes de CPCNP. El ensayo del compañero PD-L1 IHC 3 22 está validado para resecciones, biopsias de aguja de núcleo y estructura sólo si la broncoscopía rinde 100 células del tumor. Aunque con frecuencia se obtienen los tipos anteriores de la muestra, muestras citológicas son recogidas más fácilmente y el tipo de muestra más comúnmente disponibles en algunas instituciones6,7. Sin embargo, existe actualmente ningún ensayo diagnóstico validado para la evaluación de la expresión de PD-L1 en muestras de citología; confiables LDTs compatibles con muestras citológicas facilitaría aún más calidad PD-L1 prueba.
Además, al establecer la validación clínica de un LDT, la IHC debe realizarse de una manera similar a la correspondiente prueba comercial clínicamente validado8. Por ejemplo, varios pasos críticos deben ser verificadas para obtener la misma señal en secciones seriadas como titulación de anticuerpos, retrasos del tratamiento previo, tiempo de incubación y sistemas de amplificación9.
Recientemente desarrollamos un LDT optimizado que utiliza el concentrado 22 3 anticuerpos para evaluar la expresión de PD-L1 en biopsias del tumor y las muestras de citología10,11. Se encontró una alta concordancia con la LDT versus el "gold standard" PD-L1 IHC 3 22 ensayo10,11. Este protocolo clínico validado apoyo confiable y de alta calidad PD-L1 prueba en todas las regiones a nivel mundial.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NovaPrep HQ1</td>
			<td>Novacyt</td>
			<td>NA</td>
			<td>Preservative solution for cytology specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaprep&#174; HQ+ B</td>
			<td>Novacyt</td>
			<td>NA</td>
			<td>Mucolytic solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek VIP 6</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6042 VIP 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>5229 TEC 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope glass slide SuperFrost Plus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4951PLUS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph Multi Reax Vortex Shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-889-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cytoblock</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7401150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>#M365329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-L1 IHC 22C3 pharmDx</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>SK006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autostainer Link 48</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>AS480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark ULTRA autostainer</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView HQ Universal Linker</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView HRP Multimer</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Amplification H2O2</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Amplifier</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Amplification Multimer</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView DAB</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiView Copper</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin II</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#790-2208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluing Reagent</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#760-2037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Conditioning 1 (CC1)</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>#950-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Film Coverslipper</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4742</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using 22c3 anti-pd-l1 antibody concentrate on biopsy and cytology samples from non-small cell lung cancer patients

Pembrolizumab monoterapia ha sido aprobado para el tratamiento de primera y segunda línea de pacientes con PD-L1-expresando avanzado cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP). Pruebas para la expresión de PD-L1 con el ensayo diagnóstico PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22 3 acompañante, que da una proporción de tumor puntuación (TPS), ha sido validado en tejido tumoral. Hemos desarrollado una optimizado desarrollado por el laboratorio prueba (LDT) que utiliza el concentrado 22 3 anticuerpo (Ab) en un autostainer IHC ampliamente disponible para las muestras de biopsia y citología. El TPS PD-L1 fue evaluado con 120 secciones de pares todo tumor del tejido y las muestras de biopsia y con 70 emparejado muestras de biopsia y citología (lavado bronquial, n = 40; derrames pleurales, n = 30). El 22 3 que LDT basada en concentrado mostró una alta tasa de concordancia entre (~ 100%) la biopsia y citología de muestras (~ 95%) en comparación con la expresión de PD-L1 IHC determinada mediante el ensayo del compañero 3 22 PD-L1 IHC en ambos TPS cortar puntos (≥1%, ≥ 50%). La LDT optimizada presentada aquí, usando el concentrado de Ab 22 3 para determinar la expresión de PD-L1 en tanto tejido del tumor y en muestras de citología, ampliará la capacidad de los laboratorios en todo el mundo para evaluar la elegibilidad de los pacientes con NSCLC para tratamiento con monoterapia de pembrolizumab de una manera confiable y reproducible.

Utilizando el procedimiento presentado aquí y como se describe en detalle en recientes publicaciones10,11 de este grupo, LDT optimizada fue validada clínicamente con 120 archivo FFPE NSCLC biopsia las muestras de pacientes sometidos a cirugía resección o una biopsia en el Hospital Universitario de Pasteur, Niza, entre marzo de 2007 y marzo de 2016. Por otra parte, para la evaluación de la expresión de PD-L1 de muestras citol...

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Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Con 22 3 anticuerpos Anti-PD-L1 concentrarse en biopsia y muestras citológicas de pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas

Para ampliar la capacidad de los laboratorios en todo el mundo para evaluar la elegibilidad de los pacientes con cáncer de pulmón para el tratamiento con pembrolizumab, de una manera confiable y reproducible, hemos desarrollado un análisis que utiliza el concentrado 22 3 anticuerpo ampliamente disponible immunohistochemical autostainer, para muestras de biopsia y citología.

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Este método que utiliza el concentrado de anticuerpos 22C3 para determinar la expresión de PD-L1 tanto en el tejido tumoral como en la muestra de citología ampliará la capacidad de los laboratorios para evaluar la selección de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas para la inmunoterapia de una manera confiable y reproducible. La principal ventaja de esta técnica es que es altamente concordante con el ensayo estándar de oro y apoyará pruebas PD-L1 confiables y de alta calidad en todas las regiones de todo el mundo. En general, los patólogos nuevos en este método lucharán debido a la tinción granular observada ocasionalmente.Además, la tinción de las células humanas es algo más intensa que la observada con el estándar de oro. Por lo tanto, la formación de los patólogos es necesaria para obtener una interpretación correcta de la tinción PD-L1 con el LDT 22C3. Demostrando el procedimiento será la Sra.Marame Hamila, un técnico de mi laboratorio. Para comenzar, fije el tejido tumoral en formalina 10%con búfer neutro en un cassette e incruste el casete en la parafina como se describe en el protocolo de texto. Incrustar el tejido infiltrado dentro de un molde que está lleno de parafina fundida.Deje que el tejido permanezca en el molde hasta que la parafina se haya solidificado. Después de esto, utilice un microtoma para secuestrando el tejido incrustado en parafina con un grosor de tres micrómetros. Transfiera la cinta de parafina a un portaobjetos de vidrio cargado positivamente.Luego, seque el portaobjetos durante una hora a 37 grados Centígrados. En primer lugar, recoger los lavados bronquiales en una solución conservante. Transfiera los lavados a un tubo cónico de 50 mililitros.Añadir dos gramos de DL-Ditiothreitol y vórtice el tubo durante 30 minutos, luego centrifugar a 250 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y agregue 10 mililitros de una solución mucolítica. Agitar la muestra a velocidad media durante 20 minutos y centrifugar a 250 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.Después de esto, retire el sobrenadante y deposite el pellet celular en un tubo de recolección que contenga 10% de formalina neutra. Agregue cuatro gotas de un agente de preparación de bloques de celdas. Transfiera el pellet celular a un casete.Fijar el pellet celular para la incrustación y sección de parafina utilizando el proceso descrito anteriormente para la preparación de muestras de tejido tumoral. Para empezar, encienda el desatén automático y el ordenador. Haga doble clic en el icono de la opción de detección automática y elija el usuario.Haga clic en Crear etiqueta y, a continuación, en Protocolo. Haga doble clic en el protocolo 22C3. Rellene la identificación del paciente y haga clic en Imprimir.Después de esto, pegue la etiqueta en la diapositiva. Pulse el botón del cajón de diapositivas elegido para abrirlo y coloque la diapositiva etiquetada en la almohadilla térmica con la etiqueta hacia arriba y hacia adentro. Cierre el cajón de diapositivas.A continuación, retire las tapas de los dispensadores. Cargue los reactivos en el bastidor de reactivos. Abra la capucha de la trituradora y coloque los bastidores de reactivos en el carrusel de reactivos, asegurándose de que encajen correctamente y se mantengan en su posición, luego cierre la campana.En el software, haga clic en el instrumento que se utilizará y, a continuación, haga clic en Ejecutar. Al final del procedimiento IHC, utilice agua del grifo con una sola gota de solución de limpieza para enjuagar el portaobjetos durante varios segundos. Deshidrate la diapositiva sumergiéndola secuencialmente en dos baños de etanol durante varios segundos cada uno, luego coloque la diapositiva en una máquina de cobertura para cargar automáticamente el resbalón de la cubierta.Para comenzar a evaluar la calidad de la tinción PD-L1, analice los controles positivos y negativos antes de examinar la muestra del paciente. Con un microscopio, confirme la presencia de al menos 100 células tumorales viables. Con un aumento bajo de 4 veces, evalúe todas las áreas tumorales positivas y negativas bien conservadas.Después de esto, puntúe la tinción parcial o completa de la membrana celular y calcule la puntuación de la proporción tumoral evaluando la proporción de células tumorales PD-L1 positivas en relación con todas las células tumorales presentes en las áreas tumorales bien conservadas. En este estudio, la puntuación de la proporción tumoral o TPS se evalúa para muestras de biopsia de tejido emparejado en bloques de células preparados a partir de lavados bronquiales o derrames pleurales. Los patrones de tinción representativos con muestras de biopsia se utilizan para comparar el concentrado de anticuerpos 22C3 con el ensayo complementario PD-L1 IHC 22C3.El coeficiente de correlación intraclase, que se utiliza para medir la correlación de la puntuación TPS como una variable continua, es del 99% entre el LDT y el estándar de oro. Los patrones de tinción representativos con muestras de citología también se utilizan para comparar el concentrado de anticuerpos 22C3 con el ensayo complementario PD-L1 IHC 22C3. La tasa de concordancia de las muestras de biopsia y citología con el LDT es superior al 95% cuando se utiliza cualquiera de los puntos de corte del TPS.El coeficiente de correlación intraclase mientras se utiliza TPS como variable continua está entre 0,88 y 0,90. Una vez dominada, esta técnica proporciona una alta tasa de concordancia con el estándar de oro en la evaluación del límite de positividad o histología tumoral para muestras de tejido y citología. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las muestras deben evaluarse con referencia a la diapositiva HE y en algunos casos difíciles se pueden realizar manchas complementarias para evaluar las células inmunitarias para excluir la interpretación errónea de la expresión PD-L1 solo en las células tumorales.Tras este procedimiento, se pueden evaluar otros especímenes como biopsias de aguja fina, EUS-FNA o cepillos bronquiales. Después de su establecimiento en las clínicas, la solidez del ensayo debe mantenerse a lo largo del tiempo buscando la acreditación, siguiendo los procedimientos operativos estándar y participando regularmente en esquemas externos de evaluación de la calidad. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo implementar el protocolo optimizado usando el 22C3 anti-PD-L1 concentrado en un autotainer IHC ampliamente disponible tanto muestras de biopsia como de citología de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas.

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