Name: in vitro canine neutrophil extracellular trap formation: dynamic and quantitative analysis by fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Der korrespondierende Autor wurde von Morris Animal Foundation (D15CA-907) finanziert. Die Studie wurde unterstützt durch Mittel aus der University of California, Davis, Zentrum für Pferdegesundheit und Center for Companion Animal Health (2016-24-F). Die Autoren möchten Geena Ng für ihre Unterstützung bei der Figuren und Nghi Nguyen für ihre Hilfe mit dem Video zu erkennen.

Alle hier beschriebene Methoden wurden durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der University of California, Davis genehmigt (Protokoll Nummer: 18338).
1. Blutentnahme
<ol><li>Ziehen Sie 10 mL Blut aus entweder der cephalic oder Vena Ader mit einer Nadel 21 G durch Spritze absaugen.</li>
	<li>Um übermäßige Schubspannung zu vermeiden, entfernen Sie die Nadel von der Spritze vor der Übertragung von Blut in Tube(n) mit Natrium Heparin (75 USP). Die Rohre invertieren sanft...

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die,+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+Double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity.</a> The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Czaikoski, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Induce+Organ+Damage+during+Experimental+and+Clinical+Sepsis.">Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis.</a> PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).</li><li>Dwivedi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+utility+and+characterization+of+cell-free+DNA+in+patients+with+severe+sepsis.">Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis.</a> Critical Care. 16 (4), R151 (2012).</li><li>Mai, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+but+not+Early+Treatment+with+DNase+Reduces+Organ+Damage+and+Improves+Outcome+in+a+Murine+Model+of+Sepsis.">Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis.</a> Shock. 44 (2), 166-172 (2015).</li><li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dogs+cast+NETs+too:+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia.">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li><li>Letendre, J. A., Goggs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+plasma+cell-free+DNA+concentrations+in+dogs+with+sepsis,+trauma,+and+neoplasia.">Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia.</a> Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).</li><li>Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Fluorescence+Assay+for+Quantification+of+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Release.">A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li><li>Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase.">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures.">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li></ol>

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, um die Änderungen in Kernen Konformation und Blut Release in lebenden Hunde Neutrophilen mit einer Zelle permeationsfähigen Färbung und eine Zelle impermeant Farbstoff zu beobachten. Der Hauptvorteil dieser Assay ist, dass es für Echtzeit-Erkennung von Netto Bildung durch hochauflösende Mikroskopie in live Neutrophilen ohne Fixierung der Zelle, daher bietet eine einfache und wertvolles Instrument für die Beobachtung von in-vitro- NET Bildung. Da dieser Test keine Antik...

Neutrophile sind kurzlebige Granulozyten verantwortlich für die anfängliche Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger. Neutrophile, an den Ort der Infektion, rekrutiert beseitigen Mikroorganismen durch Phagozytose, Degranulation und Generierung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-1. In Anwesenheit von Bakterien oder Endotoxine verziert neutrophile Release Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen (Netze), bestehend aus extrazellulären Chromatin mit Histonen und granulare Proteine wie Elastase und Myeloperoxidase (MPO)2. Zwar Netze unverzichtbar antimikrobielle Eigenschaften, Erhöhung der experimentellen und klinischen Beweis schlägt vor, dass übereifrige NET Bildung bei Sepsis zu mehreren Organ Dysfunktion und Tod3,4, führen kann 5 , 6.
Da Netze eine ähnliche pathophysiologische Rolle bei Hunden spielen dürfen, können therapeutische Interventionen, die entweder verhindern oder verringern Netto Bildung als neue Behandlungsstrategien bei septischen Tieren dienen. Aus diesem Grund gibt es eine Notwendigkeit für eine zuverlässige Technik zu bewerten und zu quantifizieren, NETosis und NET-Komponenten bei Hunden. NET-Komponenten einschließlich zellfreie DNA (Blut) und Nukleosomen wurden zuvor im eckzahn Neutrophilen und Plasma von klinischen Hunde7,8,9bewertet. Mit Fluoreszenz-Assays, festgestellt Goggs und Letendre, dass septische Hunde höhere Niveaus von Blut als gesunde Hunde8 haben. Obwohl diese Techniken sehr objektiv und quantitative sind, ist Messung von Blut und Nukleosomen als Marker für NETosis unspezifisch, da sie von nekrotischen Zellen außer NETosing Neutrophilen abgeleitet werden können. Hier beschreiben wir eine Technik, die Fluoreszenz-Mikroskopie untersuchen die Verhalten von live NETosing Neutrophilen nutzt. Wir beschreiben auch ein modifiziertes Protokoll mit Doppel-Immunolabeling, um Netze und deren Komponenten wie MPO und citH3 in eckzahn neutrophile10subjektiv zu quantifizieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td>Molecular weight 450,000 &#8211; 650,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17144002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1285801</td>
			<td>With divalent cations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td>Without divalent cations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli O55:B5</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td>5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S7578</td>
			<td>1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface-Amps NP-40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine coated coverslips</td>
			<td>neuVitro</td>
			<td>H-12-pdl</td>
			<td>12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td>Specificity: IgG (H+L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- Myeloperoxidase antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro canine neutrophil extracellular trap formation: dynamic and quantitative analysis by fluorescence microscopy

Als Reaktion auf eindringende Krankheitserreger loslassen Neutrophilen Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen (Netze), die extrazelluläre Netzwerke von DNA mit Histonen und antimikrobielle Proteine verziert sind. Übermäßige Netto Bildung (NETosis) und citH3 Release bei Sepsis ist mit mehreren organdysfunktion und Mortalität bei Mäusen und Menschen, aber ihre Auswirkungen bei Hunden sind unbekannt. Hier beschreiben wir eine Technik, um Hunde Neutrophilen aus Vollblut zur Feststellung und Quantifizierung der NETosis zu isolieren. Leukozyten-reiche Plasma, erzeugt durch Dextran Sedimentation wird durch handelsübliche Dichte Gradienten Trennung Medien getrennt und Granulozyten gesammelt für Zell-Graf und Durchführbarkeit zu testen. Um Echtzeit-NETosis in live Neutrophilen beobachten, werden Zelle permeationsfähigen und Zelle impermeant fluoreszierenden Nukleinsäure Flecken Neutrophilen aktiviert durch Lipopolysaccharid (LPS) oder Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) hinzugefügt. Veränderungen in der nuklearen Morphologie und NET Bildung sind im Laufe der Zeit durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. In-vitro- NETosis zeichnet sich weiter durch co-ns1 zellfreie DNA (Blut), Myeloperoxidase (MPO) und citrullinierte Histon H3 (citH3) mit einem modifizierten Doppel-Immunolabelling-Protokoll. Um Objektiv zu quantifizieren, NET Bildung und citH3 Ausdruck mit Fluoreszenz-Mikroskopie, Netze und citH3-positiven Zellen in einer verblindeten Weise mit verfügbaren Software quantifiziert. Diese Technik ist eine spezifischen Assay, der in-vitro- Kapazität der eckzahn Neutrophilen NETosis unterziehen zu bewerten.

Unter Verwendung dieses Protokolls live Cell Imaging, können Ermittler der nuklearen Morphologie, Plasmamembran Integrität und Anwesenheit von Blut im lebenden Neutrophilen beobachten. Ein Zelle impermeant nuklearen Farbstoff Flecken Kerne Säuren rot in Zellen mit beschädigten Zellmembranen. Eine weitere Zelle permeationsfähigen Farbstoff, Etiketten intrazellulären Nukleinsäuren in lebenden Zellen mit intakten Plasmamembranen. Alle intakt Neutrophils, unabhängig von ihrer Behandlu...

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In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

Wir beschreiben Methoden zum isolieren eckzahn Neutrophils aus Vollblut und NET Bildung in live Neutrophilen mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu visualisieren. Protokolle, NET Bildung und citrullinierte Histon H3 zu quantifizieren sind auch beschrieben (citH3) Ausdruck mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie.

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Ein High-Throughput-Assay zu beurteilen und zu quantifizieren Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

In Vitro Stimulation und Visualisierung der extrazellulären Trap-Freisetzung in differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...