Name: in vitro canine neutrophil extracellular trap formation: dynamic and quantitative analysis by fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

इसी लेखक मॉरिस एनिमल फाउंडेशन (D15CA-९०७) द्वारा वित्त पोषित किया गया । अध्ययन के कैलिफोर्निया, डेविस, घोड़े के स्वास्थ्य और साथी पशु स्वास्थ्य के लिए केंद्र (2016-24-एफ) के लिए केंद्र के विश्वविद्यालय से धन द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक के आंकड़े और वीडियो के साथ उसकी सहायता के लिए ंघी गुयेन के साथ उसकी सहायता के लिए गीना एनजी स्वीकार करना चाहते हैं ।

सभी तरीकों यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में प्रयोग समिति, डेविस (प्रोटोकॉल संख्या: १८३३८) द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. रक्त संग्रह
<ol><li>या तो cephalic या jugular नस सिर?...

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die,+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+Double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity.</a> The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Czaikoski, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Induce+Organ+Damage+during+Experimental+and+Clinical+Sepsis.">Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis.</a> PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).</li><li>Dwivedi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+utility+and+characterization+of+cell-free+DNA+in+patients+with+severe+sepsis.">Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis.</a> Critical Care. 16 (4), R151 (2012).</li><li>Mai, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+but+not+Early+Treatment+with+DNase+Reduces+Organ+Damage+and+Improves+Outcome+in+a+Murine+Model+of+Sepsis.">Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis.</a> Shock. 44 (2), 166-172 (2015).</li><li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dogs+cast+NETs+too:+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia.">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li><li>Letendre, J. A., Goggs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+plasma+cell-free+DNA+concentrations+in+dogs+with+sepsis,+trauma,+and+neoplasia.">Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia.</a> Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).</li><li>Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Fluorescence+Assay+for+Quantification+of+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Release.">A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li><li>Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase.">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures.">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li></ol>

हम यहां मौजूद एक प्रोटोकॉल नाभिक अनुरूपता में परिवर्तन और cfDNA रिहाई में बदलाव का पालन करने के लिए एक सेल permeant डाई और एक सेल impermeant डाई का उपयोग कर न्यूट्रोफिल कुत्ते रहते हैं । इस परख का मुख्य लाभ यह है कि यह व?...

न्यूट्रोफिल कम रहते है granulocytes हमलावर रोगजनकों के खिलाफ प्रारंभिक सुरक्षा के लिए जिंमेदार है । न्यूट्रोफिल, संक्रमण की साइट के लिए भर्ती, phagocytosis, दानेदार, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS)1की पीढ़ी द्वारा सूक्ष्मजीवों को खत्म । बैक्टीरिया या endotoxins की उपस्थिति में, न्यूट्रोफिल रिलीज न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल), extracellular और क्रोमेटिन और histones (elastase)2की तरह दानेदार प्रोटीन के साथ सजाया myeloperoxidase से बना । हालांकि जाल अपरिहार्य रोगाणुरोधी गुण है, बढ़ती प्रयोगात्मक और नैदानिक सबूत पता चलता है कि पूति के दौरान अति उत्साही शुद्ध गठन कई अंग रोग और मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं3,4, 5 , 6.
क्योंकि जाल कुत्तों में एक समान pathophysiological भूमिका निभा सकता है, चिकित्सीय हस्तक्षेप है कि या तो रोकने या कम शुद्ध गठन सेप्टिक जानवरों में उपंयास उपचार रणनीतियों के रूप में सेवा कर सकते हैं । इस कारण से, वहाँ एक विश्वसनीय तकनीक का आकलन करने के लिए और कुत्तों में NETosis और शुद्ध घटकों का अंदाजा लगाने के लिए की जरूरत है । सेल सहित नेट अवयव मुक्त डीएनए (cfDNA) और nucleosomes पहले कुत्ते न्यूट्रोफिल और प्लाज्मा में नैदानिक कुत्तों7,8,9से मूल्यांकन किया गया है । प्रतिदीप्ति परख, Goggs और Letendre का उपयोग कर पाया कि सेप्टिक कुत्तों से cfDNA के उच्च स्तर है स्वस्थ8कुत्तों । हालांकि इन तकनीकों का अत्यधिक उद्देश्य और मात्रात्मक, NETosis के मार्कर के रूप में cfDNA और nucleosomes की माप गैर विशिष्ट है, क्योंकि वे NETosing न्यूट्रोफिल के अलावा अन्य कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है । यहां हम एक तकनीक है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल करने के लिए जीना NETosing न्यूट्रोफिल के व्यवहार की जांच का वर्णन । हम यह भी विस्तार से एक बार संशोधित प्रोटोकॉल का उपयोग कर डबल immunolabeling रूपसे यों तो जाल और उनके घटकों जैसे MPO और कुत्ते न्यूट्रोफिल10में citH3 के रूप में ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td>Molecular weight 450,000 &#8211; 650,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17144002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1285801</td>
			<td>With divalent cations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td>Without divalent cations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli O55:B5</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td>5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S7578</td>
			<td>1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface-Amps NP-40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine coated coverslips</td>
			<td>neuVitro</td>
			<td>H-12-pdl</td>
			<td>12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td>Specificity: IgG (H+L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- Myeloperoxidase antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro canine neutrophil extracellular trap formation: dynamic and quantitative analysis by fluorescence microscopy

रोगजनकों पर हमला करने के जवाब में, न्यूट्रोफिल रिलीज न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल), जो histones और रोगाणुरोधी प्रोटीन के साथ सजाया डीएनए के extracellular नेटवर्क हैं । अत्यधिक शुद्ध गठन (NETosis) और पूति के दौरान citH3 रिहाई चूहों और मनुष्यों में कई अंग रोग और मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है, लेकिन कुत्तों में इसके निहितार्थ अज्ञात हैं । इस के साथ साथ, हम एक तकनीक का वर्णन करने के लिए पूरे रक्त से प्रेक्षण और NETosis के ठहराव के लिए कुत्ते न्यूट्रोफिल अलग । ल्युकोसैट-रिच प्लाज्मा, dextran अवसादन द्वारा उत्पंन, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घनत्व ढाल जुदाई मीडिया और सेल गिनती और व्यवहार्यता परीक्षण के लिए एकत्र granulocytes द्वारा अलग है । लाइव न्यूट्रोफिल में रीयल-टाइम NETosis का निरीक्षण करने के लिए, सेल permeant और सेल impermeant फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग को न्यूट्रोफिल (lipopolysaccharide) या एलपीएस 12-phorbol 13-myristate (पमा) द्वारा या तो सक्रिय करने के लिए जोड़ा जाता है । परमाणु आकृति विज्ञान और शुद्ध गठन में परिवर्तन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा समय के साथ मनाया जाता है । इन विट्रो में NETosis आगे कोशिका मुक्त डीएनए (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) और फॉस्फोलिपिड lgg हिस्टोन H3 (citH3) एक संशोधित डबल-immunolabelling प्रोटोकॉल का उपयोग कर के सह-colocalization द्वारा विशेषता है । शुद्ध गठन और citH3 अभिव्यक्ति प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, जाल और citH3-सकारात्मक कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए एक अंधा तरीके से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर quantified हैं । इस तकनीक को एक विशिष्ट परख के लिए इन विट्रो में कुत्ते न्यूट्रोफिल की क्षमता का मूल्यांकन NETosis से गुजरना है ।

लाइव सेल इमेजिंग के इस प्रोटोकॉल का उपयोग, जांचकर्ताओं परमाणु आकृति विज्ञान, प्लाज्मा झिल्ली अखंडता और रहने वाले न्यूट्रोफिल में cfDNA की उपस्थिति का पालन कर सकते हैं । एक सेल impermeant परमाणु डाई ?...

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In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

हम पूरे रक्त से कुत्ते न्यूट्रोफिल को अलग करने और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग लाइव न्यूट्रोफिल में शुद्ध गठन कल्पना करने के लिए तरीकों का वर्णन । यह भी वर्णित प्रोटोकॉल के लिए शुद्ध गठन और फॉस्फोलिपिड lgg हिस्टोन H3 (citH3) अभिव्यक्ति इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर रहे हैं ।

इन विट्रो में कुत्ते न्युट्रोफिल Extracellular जाल गठन: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा गतिशील और मात्रात्मक विश्लेषण

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Research

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The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

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मात्रात्मक<em&gt; इन विट्रो में</emस्टेटिक शर्तों के तहत सक्रिय प्राथमिक मानव microvascular endothelial कोशिकाओं को न्युट्रोफिल आसंजन उपाय&gt; परख

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

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विधियों का अध्ययन करने के लिए न्यूट्रोफिल में लिपिड बदलाव और न्युट्रोफिल कोशिकी जाल के बाद के गठन

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

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कुत्ते न्युट्रोफिल कोशिकी जाल रिलीज की मात्रा का ठहराव के लिए एक सरल प्रतिदीप्ति परख

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

एक उच्च प्रवाह परख का आकलन करने के लिए और न्युट्रोफिल Extracellular जाल गठन यों तो

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

विट्रो उत्तेजना और विक्षेत मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज में extracellular ट्रैप रिलीज के दृश्य

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...