Name: in vitro canine neutrophil extracellular trap formation: dynamic and quantitative analysis by fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Tilsvarende forfatter ble finansiert av Morris dyr Foundation (D15CA-907). Studien ble støttet av midler fra University of California, Davis, senter for Equine helse og senter for følgesvenn dyr sunnhet (2016-24-F). Forfatterne ønsker å erkjenne Geena Ng for henne hjelp med tall og Nghi Nguyen for henne hjelp med video.

Alle metodene som er beskrevet her ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved University of California, Davis (protokoll nummer: 18338).
1. blod samling
<ol><li>Trekke 10 mL blod fra enten cephalic eller jugulare venen bruker en 21 G nål av sprøyte aspirasjon.</li>
	<li>For å unngå overdreven skjæring stress, fjerne nålen fra sprøyten før du overfører blod i lysrør som inneholder natrium heparin (75 USP). Forsiktig Inverter rør noen ganger å sikre tilstrekke...

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die,+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+Double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity.</a> The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Czaikoski, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Induce+Organ+Damage+during+Experimental+and+Clinical+Sepsis.">Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis.</a> PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).</li><li>Dwivedi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+utility+and+characterization+of+cell-free+DNA+in+patients+with+severe+sepsis.">Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis.</a> Critical Care. 16 (4), R151 (2012).</li><li>Mai, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+but+not+Early+Treatment+with+DNase+Reduces+Organ+Damage+and+Improves+Outcome+in+a+Murine+Model+of+Sepsis.">Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis.</a> Shock. 44 (2), 166-172 (2015).</li><li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dogs+cast+NETs+too:+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia.">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li><li>Letendre, J. A., Goggs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+plasma+cell-free+DNA+concentrations+in+dogs+with+sepsis,+trauma,+and+neoplasia.">Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia.</a> Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).</li><li>Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Fluorescence+Assay+for+Quantification+of+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Release.">A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li><li>Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase.">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures.">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li></ol>

Vi presenterer her en protokoll for å observere endringene i kjerner conformation og cfDNA utgivelse i levende hjørnetann nøytrofile med både en celle permeant fargestoff og en celle impermeant fargestoff. Den største fordelen med denne analysen er at det tillater for sanntids deteksjon av netto dannelsen av høy oppløsning mikroskopi i live nøytrofile uten celle fiksering, derfor gir et enkelt og nyttig verktøy for å observere i vitro netto formasjon. Siden denne analysen ikke krever antistoffer for p?...

Nøytrofile er kortvarige granulocytter ansvarlig for det første forsvaret mot invaderende patogener. Nøytrofile, rekruttert til området av smitte, eliminerer mikroorganismer fagocytose, omfatter degranulering og generasjon av reaktive oksygen arter (ROS)1. I nærvær av bakterier eller endotoxins dekorert nøytrofile utgivelsen nøytrofile ekstracellulære feller (nett), består av ekstracellulære chromatin med histones og detaljert proteiner som elastase og myeloperoxidase (MPO)2. Selv om garn har uunnværlig antimikrobielle egenskaper, antyder øke experimental og klinisk bevis at overivrig netto formasjon under sepsis kan føre til flere orgel dysfunksjon og død3,4, 5 , 6.
Fordi garn kan spille en liknende patofysiologiske rolle i hunder, kan terapeutisk intervensjon som forhindre eller redusere netto formasjon tjene som ny behandling strategier i septisk dyr. Derfor er det behov for en pålitelig teknikk for å vurdere og kvantifisere NETosis og netto komponenter i hundene. NET komponenter, inkludert celle-gratis DNA (cfDNA) og nucleosomes har tidligere blitt evaluert i hjørnetann nøytrofile og plasma klinisk hundene7,8,9. Bruker fluorescens analyser, fant Goggs og Letendre at septisk hunder har høyere nivåer av cfDNA enn rask hundene8. Selv om disse teknikkene er svært objektive og kvantitativ, er måling av cfDNA og nucleosomes som angir NETosis uspesifisert siden de kan utledes fra nekrotisk celler enn NETosing nøytrofile. Her beskriver vi en teknikk som bruker fluorescens mikroskopi for å undersøke atferd av live NETosing nøytrofile. Vi har også detalj en endret protokoll med dobbel-immunolabeling subjektivt kvantifisere garn og deres komponenter som MPO og citH3 i hjørnetann nøytrofile10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td>Molecular weight 450,000 &#8211; 650,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17144002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1285801</td>
			<td>With divalent cations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td>Without divalent cations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli O55:B5</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td>5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S7578</td>
			<td>1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface-Amps NP-40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine coated coverslips</td>
			<td>neuVitro</td>
			<td>H-12-pdl</td>
			<td>12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td>Specificity: IgG (H+L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- Myeloperoxidase antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro canine neutrophil extracellular trap formation: dynamic and quantitative analysis by fluorescence microscopy

Svar på invaderende patogener, slipp nøytrofile nøytrofile ekstracellulære feller (nett), som er ekstracellulære nettverk av DNA dekorert med histones og antimikrobielle proteiner. Overdreven netto dannelse (NETosis) og citH3 utgivelse i sepsis er tilknyttet flere orgel dysfunksjon og dødelighet i mus og mennesker, men konsekvensene i hunder er ukjent. Her, beskriver vi en teknikk for å isolere hjørnetann nøytrofile fra fullblod for observasjon og kvantifisering av NETosis. Leukocytter-rich plasma, generert av dekstran sedimentering, deles av kommersielt tilgjengelig tetthet gradert separasjon media og granulocytter samlet antall og levedyktighet testing. For å observere sanntid NETosis i live nøytrofile, legges cellen permeant og celle impermeant fluorescerende nukleinsyre flekker til nøytrofile aktivert lipopolysakkarid (LPS) eller phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Endringer i kjernefysiske morfologi og netto formasjon er observert over tid ved fluorescens mikroskopi. In vitro NETosis er mer preget av co-colocalization av celle-gratis DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) og citrullinated histone H3 (citH3) bruker en modifisert dobbel-immunolabelling-protokoll. Å objektivt kvantifisere netto dannelse og citH3 uttrykk med fluorescens mikroskopi, garn og citH3-positive celler er kvantifisert på forblindet måte med tilgjengelig programvare. Denne teknikken er en bestemt analysen vurdere i vitro kapasiteten av hjørnetann nøytrofile å gjennomgå NETosis.

Bruker denne protokollen, om levende celle bildebehandling, kan etterforskere observere kjernefysiske morfologi, plasma membranen integritet og tilstedeværelsen av cfDNA i levende nøytrofile. En celle impermeant kjernefysiske fargestoffet flekker kjerner syrer rød i celler med skadede. En annen celle-permeant fargestoff, etiketter intracellulær nucleic syrer i levende celler med intakt plasma membraner. Alle intakt nøytrofile, uansett deres behandlinger, bør vises grønne og viser k...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

Vi beskriver metoder for å isolere hjørnetann nøytrofile fra hele blod og visualisere netto formasjon i live nøytrofile bruker fluorescens mikroskopi. Også beskrevet er protokoller å kvantifisere netto dannelse og citrullinated histone H3 (citH3) uttrykk med immunofluorescence mikroskopi.

In Vitro Hjørnetann nøytrofile ekstracellulære felle formasjon: Dynamisk og kvantitativ analyse av fluorescens mikroskopi

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analysen for å måle Neutrophil vedheft til Aktiverte primære humane mikrovaskulær endotelceller under statiske betingelser

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Høy gjennomstrømning Måling av ekstracellulært DNA Slipp og kvantitative NET-formasjonen i Human Neutrophils<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Måling Phagosome pH ved Proporsjonellekspansjon Fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder for å studere Lipidendringer av nøytrofile granulocytter og etterfølgende dannelse av Neutrofil Ekstracellulær feller

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

En enkel Fluorescens analyse for Kvantifisering av Canine nøytrofile ekstracellulær felle utløsning

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

En høy gjennomstrømming analysen vurdere og kvantifisere nøytrofile ekstracellulære felle formasjon

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

In vitro stimulering og visualisering av ekstracellulære Trap Release i differensiert Human monocytt-avledet makrofager

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...