Name: in vitro differentiation of mouse granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (gm-csf)-producing t helper (thgm) cells
Uploaded: 2018-09-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells at JoVE.com

Cette étude a été financée par des subventions de l’Université nationale santé système de Singapour (T1-2014 Oct-12 et T1-2015 Sep-10).

Toutes les souris utilisées dans le présent protocole ont été sur le bagage génétique de C57BL/6 et logés dans des conditions spécifiques à la National University of Singapore exempts de micro-organismes pathogènes. Toutes les expériences ont été effectuées à l’aide de protocoles approuvés par le Comité de l’urbanisme de l’Université nationale de Singapour et d’institutionnels animalier.
1. réactif et préparation du matériel
<ol><li>Préparer 500 mL d’une solut...

<ol>
	<li>Zhu, J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells:+fates,+functions,+and+faults.">CD4 T cells: fates, functions, and faults.</a> Blood. 112, 1557-1569 (2008).</li><li>Kara, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+immune+responses:+novel+effector+helper+T+cell+subsets+in+protective+immunity.">Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity.</a> PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).</li><li>Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Immunology+meets...Immunology:+Modified+cancer+cells+as+professional+APC+for+priming+naive+tumor-specific+CD4++T+cells.">Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells.</a> Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).</li><li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TH17+cells+in+development:+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming.">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).</li><li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17+and+Th17+Cells.">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).</li><li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT5+programs+a+distinct+subset+of+GM-CSF-producing+T+helper+cells+that+is+essential+for+autoimmune+neuroinflammation.">STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation.</a> Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).</li><li>Codarri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORgammat+drives+production+of+the+cytokine+GM-CSF+in+helper+T+cells,+which+is+essential+for+the+effector+phase+of+autoimmune+neuroinflammation.">RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation.</a> Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).</li><li>El-Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+encephalitogenicity+of+T(H)17+cells+is+dependent+on+IL-1-+and+IL-23-induced+production+of+the+cytokine+GM-CSF.">The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF.</a> Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).</li><li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17++T+helper+cells.">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126, 1121-1133 (2006).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+subset+of+helper+T+cells+promotes+immune+responses+by+secreting+GM-CSF.">A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).</li><li>Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+in+Neuroinflammation:+Licensing+Myeloid+Cells+for+Tissue+Damage.">GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage.</a> Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).</li></ol>

Ici, nous avons décrit un protocole d’une différenciation de THGM in vitro de cellules de souris naïves CD4 +, suivie d’une analyse des cellules différenciées pour valider la méthode. À noter, rate et les ganglions lymphatiques peut être utilisés pour naïve purification de cellules T CD4 + et différenciation THGM. L’expression de cytokines déterminée par cytokine intracellulaire coloration combiné avec écoulement cytometry a montré qu’environ 55 % des cellules ont é...

Cellules CD4 + T auxiliaires (TH) sont des éléments essentiels du système immunitaire, ayant un rôle crucial dans la défense de l’hôte contre les agents pathogènes microbiens, dans la surveillance du cancer et l’auto-immunité1,2,3. Lors de l’activation de récepteur (TCR) de lymphocytes T, cellules T CD4 naïves peuvent être différenciés en TH1, TH2, TH 17, ou réglementaires T (Treg) cellules sous l’influence de cytokines différents milieux2,4, 5. récemment, un sous-ensemble de nouveau des cellules TH , qui produit principalement des GM-CSF, a été identifié et nommé THGM6. La différenciation des cellules THGM est entraînée par l’IL-7 par le biais de l’activation d’un transducteur de signal et un activateur de transcription 5 (STAT5). Ces cellules expriment une grande quantité de GM-CSF tout en ayant une faible expression des autres TH-cell signature cytokines telles que l’IFNγ et IL-176. GM-CSF s’est avéré jouent un rôle essentiel dans le développement de CD4 + T cell-mediated neuroinflammation7,,8. Par rapport à IFNγ ou IL-17-exprimant des cellules autoréactives T, T exprimant le GM-CSF cellules transférés à sauvage souris (WT) faits une apparition précoce de la maladie et la gravité de la maladie. En outre, les cellules de T de Csf2- / - n’a pu induire encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) après avoir été transféré Moutschen aux destinataires WT, tandis que les cellules T dépourvues d’IFNγ ou IL-17 a conservé la capacité de provoquer des EAE7. En outre, un blocus de GM-CSF à l’aide d’anticorps neutralisants amélioré EAE maladie gravité8. En outre, une carence de STAT5 dans les cellules T chez les souris a entraîné dans une génération THGM diminuée et, partant, à une résistance des souris EAE développement6. Ces résultats soulignent l’importance des lymphocytes T exprimant le GM-CSFH de maladie auto-immune thérapeutiques. Ainsi, en établissant une méthode pour différencier les cellules T exprimant le GM-CSFH de cellules T CD4 + naïve serait important dans l’étude de la pathogenèse de la neuro-inflammation auto-immune et immunité à médiation cellulaire T. Toutefois, un protocole qui efficacement génère des cellules THGM de murin naïf que CD4 + n’a pas été établi.
Nous présentons ici une méthode qui se différencie des cellules THGM de cellules T CD4 naïves. Ce protocole décrit l’ensemble de la procédure, y compris l’extraction de la rate de la souris, la préparation d’une suspension de cellules individuelles, la sélection positive de CD4, la cellule activée par fluorescence triant (FACS) et la cellule TH différenciation et l’analyse. Lymphocytes T helper différenciés sont analysés par cytokine intracellulaire coloration combinée avec écoulement cytometry pour déterminer l’expression de cytokines au niveau unicellulaire, par une PCR quantitative en temps réel afin de déterminer l’expression de cytokines au niveau de l’ARNm, et par ELISA pour évaluer l’expression de cytokines au niveau de la protéine. Cette méthode peut être appliquée aux études de biologie cellulaire THGM dans diverses conditions, telles que EAE, où GM-CSF joue un rôle important dans la pathogenèse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Heat Inactivated</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-HI-12A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-2040-10</td>
			<td>Diluted to 1x PBS in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-1053-100ml-pH8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X ACK buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td>diluted in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>93070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony SY3200 cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>Sony SY3200 cell sorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15m conical centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-0041-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human/mouse CD44 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0441-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD62L FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0621-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer-improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Trypan Blue Solution</td>
			<td>GE healthcare Life Sciences</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Elipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified&#160;anti-mouse CD3e&#160;antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified hamster anti-mouse CD28</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat&#160;anti-mouse IFN&#947; &#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>16-7312-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-mouse IL-4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>504102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-7 Protein</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-6</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>406&#8209;ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human TGF-beta</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>19-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiPlug protein transport inhibitor</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>51-2301KZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular Fixation&#38;Permeabilization buffer set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse GM-CSF PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7331-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse IL-17A</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>506908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-gamma</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO Taq qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>88-7334-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A Uncouted ELISA</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>88-7371-22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation of mouse granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (gm-csf)-producing t helper (thgm) cells

Le granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-produisant des lymphocytes T helper (THGM) est un sous-ensemble de cellules d’assistance T nouvellement identifié qui principalement sécrète GM-CSF sans produire l’interféron (IFN) γ ou interleukine (IL) -17 et se trouve à jouent un rôle essentiel dans la neuro-inflammation auto-immune. Une méthode d’isolement de cellules T CD4 + naïf d’une suspension de cellules individuelles des splenocytes et génération de cellules THGM de cellules T CD4 + naïve serait une technique utile dans l’étude de l’immunité à médiation cellulaire T et maladies auto-immunes. Nous décrivons ici une méthode qui le différencie des cellules T CD4 + naïf de souris en cellules THGM promues par l’IL-7. Le résultat de la différenciation a été évalué par l’analyse de l’expression de cytokines à l’aide de différentes techniques, notamment des cytokines intracellulaires coloration combinée avec la cytométrie en flux, une quantitative PCR en temps réel (PCR), et dosages immuno-enzymatiques (ELISA). Utilisant le protocole de différenciation THGM comme décrit ici, environ 55 % des cellules exprimé GM-CSF avec une expression minimale d’IFNα ou IL-17. L’expression prédominante de GM-CSF par les cellules THGM a été confirmée par l’analyse de l’expression du GM-CSF, IL-17 niveaux d’ARNm et protéines et IFNα. Ainsi, cette méthode peut être utilisée pour différencier les cellules T CD4 + naïf à THGM cellules in vitro, qui sera utile dans l’étude de la biologie cellulaire THGM.

Les cellules T CD4 + naifs isolées de deux souris C57BL/6 mâles de 8 semaines ont été divisés en trois parties. Une portion des cellules est différenciée en suivant le protocole décrit les cellules THGM. Une autre partie a été cultivée dans des conditions THGM en présence d’anticorps anti-IL-4 (10 µg/mL) pour tester l’influence d’un blocus de l’IL-4 dans la différenciation des THGM. La dernière partie a été cultivée dans un état ...

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In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells

In Vitro Différenciation des souris Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-production de cellules T auxiliaires (THGM)

Nous présentons ici un protocole pour différencier murin granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing cellules T auxiliaires (THGM) de cellules CD4 + T naïves, notamment l’isolement des cellules CD4 + T naïves, différenciation des THGM, et analyse des cellules THGM différenciées. Cette méthode peut être appliquée aux études de la régulation et fonction des cellules THGM.

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transduction rétrovirale des récepteurs de cellules T dans les lymphocytes T de souris

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

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L&#39;isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

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Rétrovirale transduction des cellules T auxiliaires comme une approche génétique pour étudier les mécanismes contrôlant leur différenciation et la fonction

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4 + FOXP3 cellules + Induced T régulatrices (de iTregs) de Naïf cellules T CD4 + en utilisant un protocole TGF-β contenant

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...