Name: in vitro differentiation of mouse granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (gm-csf)-producing t helper (thgm) cells
Uploaded: 2018-09-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells at JoVE.com

本研究は、シンガポール国立大学健康システム (T1 ~ 2014 年 10 月 12、T1-2015 年 9 月-10) からの助成金によって支えられました。

このプロトコルで使用されるすべてのマウス C57BL/6 遺伝的背景、シンガポール国立大学で特定の病原体フリーの条件の下に収容します。動物介護制度とシンガポール国立大学の利用委員会によって承認されたプロトコルを使用してすべての実験を行った。
1. 試薬および材料の準備
<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2% ウシ胎児血清 (FBS) と 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (ED...

<ol>
	<li>Zhu, J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells:+fates,+functions,+and+faults.">CD4 T cells: fates, functions, and faults.</a> Blood. 112, 1557-1569 (2008).</li><li>Kara, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+immune+responses:+novel+effector+helper+T+cell+subsets+in+protective+immunity.">Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity.</a> PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).</li><li>Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Immunology+meets...Immunology:+Modified+cancer+cells+as+professional+APC+for+priming+naive+tumor-specific+CD4++T+cells.">Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells.</a> Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).</li><li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TH17+cells+in+development:+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming.">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).</li><li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17+and+Th17+Cells.">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).</li><li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT5+programs+a+distinct+subset+of+GM-CSF-producing+T+helper+cells+that+is+essential+for+autoimmune+neuroinflammation.">STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation.</a> Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).</li><li>Codarri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORgammat+drives+production+of+the+cytokine+GM-CSF+in+helper+T+cells,+which+is+essential+for+the+effector+phase+of+autoimmune+neuroinflammation.">RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation.</a> Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).</li><li>El-Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+encephalitogenicity+of+T(H)17+cells+is+dependent+on+IL-1-+and+IL-23-induced+production+of+the+cytokine+GM-CSF.">The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF.</a> Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).</li><li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17++T+helper+cells.">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126, 1121-1133 (2006).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+subset+of+helper+T+cells+promotes+immune+responses+by+secreting+GM-CSF.">A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).</li><li>Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+in+Neuroinflammation:+Licensing+Myeloid+Cells+for+Tissue+Damage.">GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage.</a> Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).</li></ol>

ここで我々 は、体外THGM から分化メソッドを検証する分化した細胞の解析に続いてマウス ナイーブ cd4 細胞のプロトコルを記述しました。注記のうち、脾臓およびリンパ節はナイーブ cd4 T 細胞の浄化と THGM 分化に使えます。THGM 条件 (図 1 a) GM CSF 発現細胞になる細胞内サイトカイン染色細胞の約 55%, フローサイトメトリーと組み合わせて?...

ヘルパー (TH) cd4 T 細胞、微生物病原体に対する生体防御、癌サーベイランスおよび自己免疫1,2,3重要な役割を持つ免疫システムに不可欠なコンポーネントです。T 細胞受容体 (TCR) 活性化 THTH2 1 ナイーブ cd4 陽性 T 細胞が分化することができます、異なるサイトカイン ミリュー2,4,の影響の下で T (Treg) 細胞を TH 17、または規制5します。 最近、GM-CSF を主に生産、新しい THセルのサブセットを特定され、THGM6の名前。THGM 細胞の分化は、信号変換器の活性化と転写 5 (STAT5) の活性化を介して IL-7 によって駆動されます。これらの細胞は他の T のHの低発現しながら GM-CSF の大量を表現-署名サイトカイン肝腎と IL-176などを携帯します。GM-CSF cd 4 + T 細胞を介した neuroinflammation7,8の開発に重要な役割を果たすことがわかった。肝腎- または IL-17-を表現する自己反応性 T 細胞と比較して、GM CSF 表現 T 細胞、野生型に転送 (WT) マウス以前の発症および重症度高いです。また、 Csf2-/- T 細胞は WT の受信者に転送される利用後実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) を誘導するために失敗しました肝腎や IL 17A 欠けて T 細胞 EAE7を仲介する能力を保持するのに対し。また、中和抗体を用いた GM-CSF の封鎖は EAE 病重症度8を改善しました。さらに、マウスの T 細胞に STAT5 の欠乏は、EAE 開発6に減少 THGM 世代と、それゆえ、マウスの抵抗を起因しました。これらの調査結果は、自己免疫性アミロイド疾患における GM CSF 表現 TH細胞の重要性を強調します。したがって、ナイーブ cd4 陽性 T 細胞から GM CSF 表現 TH細胞を区別する方法を確立する自己免疫 neuroinflammation と T 細胞を介した免疫反応の機序の解明に重要となります。しかし、プロトコルを効率的にセルを生成する THGM マウス ナイーブ cd4 が確立されていないから。
ナイーブ cd4 陽性 T 細胞からマウスの THGM 細胞を区別する方法をご紹介します。このプロトコルはマウスから脾臓の抽出、TH細胞蛍光活性化セル (FACS) を並べ替え、CD4 の正の選択単一細胞懸濁液の準備などを含む全体の手順を記述します。微分法と解析。差別化されたヘルパー T 細胞は、細胞内サイトカインの mRNA レベルでのサイトカインの発現を決定する定量的リアルタイム PCR による単一細胞レベルでのサイトカインの発現をフローサイトメトリーと組み合わせて染色によって分析されるとタンパク質レベルでのサイトカインの発現を評価するために ELISA によるこのメソッドは、惹起、GM-CSF が病因に重要な役割を果たしているなど、様々 な条件の下で THGM 細胞生物学の研究に適用できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Heat Inactivated</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-HI-12A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-2040-10</td>
			<td>Diluted to 1x PBS in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-1053-100ml-pH8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X ACK buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td>diluted in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>93070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony SY3200 cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>Sony SY3200 cell sorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15m conical centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-0041-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human/mouse CD44 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0441-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD62L FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0621-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer-improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Trypan Blue Solution</td>
			<td>GE healthcare Life Sciences</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Elipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified&#160;anti-mouse CD3e&#160;antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified hamster anti-mouse CD28</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat&#160;anti-mouse IFN&#947; &#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>16-7312-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-mouse IL-4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>504102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-7 Protein</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-6</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>406&#8209;ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human TGF-beta</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>19-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiPlug protein transport inhibitor</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>51-2301KZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular Fixation&#38;Permeabilization buffer set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse GM-CSF PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7331-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse IL-17A</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>506908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-gamma</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO Taq qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>88-7334-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A Uncouted ELISA</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>88-7371-22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation of mouse granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (gm-csf)-producing t helper (thgm) cells

顆粒球マクロファージ ・ コロニー刺激因子 (GM-CSF)-(THGM) ヘルパー T 細胞の生産は主にインターフェロン (IFN) γ やインターロイキン (IL)-17 を伴わず GM-CSF を分泌して認められる新たに同定された T のヘルパー細胞サブセット自己免疫 neuroinflammation で重要な役割を果たします。脾細胞の単一細胞懸濁液からナイーブ cd4 陽性 T 細胞および THGM セル生成ナイーブ cd4 陽性 T 細胞からの分離の方法は、T 細胞性免疫や自己免疫疾患の研究に有用な技術でしょう。ここで IL-7 によって促進される THGM セルにマウス ナイーブ cd4 陽性 T 細胞を区別する方法をについて説明します。細胞内サイトカイン染色、フローサイトメトリー、量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の組み合わせを含む、さまざまなテクニックを用いたサイトカイン発現の解析によって評価された分化の結果、酵素抗体法 (ELISA)。THGM 分化プロトコルをここで前述の使用細胞の約 55% はインターフェロンや IL 17 の最小表現と GM-CSF を表現しました。THGM 細胞に GM-CSF の優勢な式は、GM-CSF、インターフェロン、IL-17 mRNA とタンパク質レベルでの発現解析によってさらに確認されました。したがって、このメソッドは T にナイーブ cd4 陽性 T 細胞を区別するために使用できるHGM 細胞の in vitro、THGM 細胞生物学の研究に有用となります。

2 つの 8 週齢雄 c57bl/6 マウスから分離したナイーブ cd4 陽性 T 細胞は、3 つの部分に分けられました。セルの 1 つの部分だった説明されたプロトコルを次 THGM 細胞へと分化します。別の部分を THGM の分化における IL 4 封鎖の影響をテストする抗 IL 4 抗体 (10 μ G/ml) の存在下で THGM 条件下で培養しました。最後の部分を (3 μ g/mL 抗 CD3e 1 μ g/mL 抗 CD2...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells at JoVE.com

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells

体外分化マウス顆粒球マクロファージ ・ コロニー刺激因子 (GM-CSF)-(THGM) ヘルパー T 細胞の生産

ここで、ナイーブ cd4 陽性 T 細胞、THGM の分化の分離を含む、ナイーブ cd4 陽性 T 細胞からマウスの granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM) ヘルパー細胞を区別するためにプロトコルを提案し、THGM の分化した細胞の解析。このメソッドは、規制の研究と THGM 細胞の機能に適用できます。

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

ナイーブCD4のアデノウイルス形質導入Tregの分化を研究するためにT細胞

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

効率的なためキラー人工抗原提示細胞（KaAPC）<em&gt;体外</em&gt;ヒト抗原特異的T細胞の枯渇

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

T細胞の導出<em&gt;体外</em&gt;マウス胚性幹細胞からの

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

TGF-βを含むプロトコルを使用したナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 +誘導された調節性T細胞（iTregs）のインビトロ分化における

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

体外分化マウス顆粒球マクロファージ ・ コロニー刺激因子 (GM-CSF)-(THGM) ヘルパー T 細胞の生産

体外分化マウス顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子 (GM-CSF)-(T_HGM) ヘルパー T 細胞の生産