Name: in vitro differentiation of mouse granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (gm-csf)-producing t helper (thgm) cells
Uploaded: 2018-09-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells at JoVE.com

Это исследование было поддержано субсидий из национального университета здравоохранения системы Сингапура (T1-2014-Окт-12 и 10 сентября T1-2015).

Все мыши, используемые в настоящем протоколе были на фоне генетических C57BL/6 и размещается в определенных условиях свободной от возбудителя в национальном университете Сингапура. Все эксперименты проводились с использованием протоколов, одобренных институциональный уход животных и и...

<ol>
	<li>Zhu, J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells:+fates,+functions,+and+faults.">CD4 T cells: fates, functions, and faults.</a> Blood. 112, 1557-1569 (2008).</li><li>Kara, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+immune+responses:+novel+effector+helper+T+cell+subsets+in+protective+immunity.">Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity.</a> PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).</li><li>Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Immunology+meets...Immunology:+Modified+cancer+cells+as+professional+APC+for+priming+naive+tumor-specific+CD4++T+cells.">Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells.</a> Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).</li><li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TH17+cells+in+development:+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming.">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).</li><li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17+and+Th17+Cells.">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).</li><li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT5+programs+a+distinct+subset+of+GM-CSF-producing+T+helper+cells+that+is+essential+for+autoimmune+neuroinflammation.">STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation.</a> Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).</li><li>Codarri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORgammat+drives+production+of+the+cytokine+GM-CSF+in+helper+T+cells,+which+is+essential+for+the+effector+phase+of+autoimmune+neuroinflammation.">RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation.</a> Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).</li><li>El-Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+encephalitogenicity+of+T(H)17+cells+is+dependent+on+IL-1-+and+IL-23-induced+production+of+the+cytokine+GM-CSF.">The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF.</a> Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).</li><li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17++T+helper+cells.">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126, 1121-1133 (2006).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+subset+of+helper+T+cells+promotes+immune+responses+by+secreting+GM-CSF.">A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).</li><li>Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+in+Neuroinflammation:+Licensing+Myeloid+Cells+for+Tissue+Damage.">GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage.</a> Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).</li></ol>

Здесь мы описали протокол в vitro THGM дифференциации от мыши наивно CD4 + клеток, следуют анализ дифференцированных клеток для проверки метода. Следует отметить селезенке и лимфатических узлах может использоваться для наивного CD4 + Т-клеток очистки и THGM дифференциации. Выраж...

Хелперы CD4 + T (TH) являются важнейшими компонентами иммунной системы, что решающую роль в принимающей обороны против патогенных микроорганизмов, наблюдения рак и аутоиммунные заболевания1,2,3. После активации клеток T рецептор (TCR) наивно CD4 + Т-клеток могут быть дифференцированы в TH1, T 2H, TH 17, или регулирования T (Treg) клеток под влиянием различных цитокинов кругах2,4, 5. Недавно, новый подмножество клеток TH , который преимущественно производит ГМ-КСФ, определены и назвал THGM6. Дифференцировка клеток THGM обусловлено IL-7 путем активации сигнала датчика и активатор транскрипции 5 (STAT5). Эти клетки выразить большое количество ГМ-КСФ имея низкий выражение других TH-клетки подпись цитокинов, таких как IFNγ и IL-176. Было установлено, что ГМ-КСФ играть решающую роль в развитии CD4 + Т клеток опосредованной neuroinflammation7,8. По сравнению с IFNγ - или ил-17-выражая аутореактивная Т-клеток, ГМ-КСФ выражая T клетки передана одичал тип (WT) мышей вызвало ранее заболевания и более высокой тяжести заболевания. Кроме того клетки T Csf2- / - не побудить Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) после восприимчивую передается WT получателям, тогда как Т-клетки, не хватает IFNγ или ил 17а сохранили способность посредником ЕАЕ7. Кроме того блокада ГМ-КСФ использование нейтрализующих антител смягчены ЕАЕ болезни тяжести8. Кроме того дефицит STAT5 в Т-клетки мышей привело в уменьшилось поколения THGM и, следовательно, сопротивление мышей ЕАЕ развития6. Эти выводы подчеркивают важность ГМ-КСФ выражая TH клеток в neuroinflammatory аутоиммунных заболеваний. Таким образом установление метода дифференцировать ГМ-КСФ выражая TH клетки от наивного CD4 + Т-клеток было бы важно в изучении патогенеза аутоиммунного neuroinflammation и T клеточного иммунного ответа. Однако протокол, эффективно создает THGM клетки из мышиных наивен, что CD4 + установлено не было.
Здесь мы представляем метод, который отличает мышиных THGM клетки от наивного CD4 + Т-клеток. Этот протокол описывает всю процедуру, включая извлечение хандры от мыши, подготовка одноклеточных подвеска, выбор положительный CD4, активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) и клеток TH дифференциация и анализа. Дифференцированные Т-хелперы анализируются внутриклеточных цитокинов, пятнать в сочетании с проточной цитометрии определить выражение cytokine на уровне одной ячейки, Количественная ПЦР в реальном времени чтобы определить выражение cytokine на уровне мРНК, и по ELISA оценить выражение cytokine уровня белка. Этот метод может применяться для исследования биологии клетки THGM в различных условиях, таких как ЕАЕ, где ГМ-КСФ играет важную роль в патогенезе.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Heat Inactivated</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-HI-12A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-2040-10</td>
			<td>Diluted to 1x PBS in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-1053-100ml-pH8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X ACK buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td>diluted in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>93070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony SY3200 cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>Sony SY3200 cell sorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15m conical centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-0041-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human/mouse CD44 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0441-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD62L FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0621-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer-improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Trypan Blue Solution</td>
			<td>GE healthcare Life Sciences</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Elipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified&#160;anti-mouse CD3e&#160;antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified hamster anti-mouse CD28</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat&#160;anti-mouse IFN&#947; &#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>16-7312-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-mouse IL-4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>504102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-7 Protein</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-6</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>406&#8209;ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human TGF-beta</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>19-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiPlug protein transport inhibitor</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>51-2301KZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular Fixation&#38;Permeabilization buffer set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse GM-CSF PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7331-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse IL-17A</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>506908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-gamma</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO Taq qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>88-7334-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A Uncouted ELISA</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>88-7371-22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation of mouse granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (gm-csf)-producing t helper (thgm) cells

Гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ)-производство клеток T вспомогательный (THGM) является подмножеством недавно выявленных вспомогательные клетки T, что преимущественно выделяет ГМ-КСФ без производства Гамма интерферон (ИФН) или интерлейкина (IL) -17 и оказывается играть важную роль в аутоиммунных neuroinflammation. Метод изоляции клеток CD4 + T наивно от одноклеточного приостановления splenocytes и поколения клетки THGM от наивного CD4 + Т-клеток было бы полезным методом в исследовании T клеточный иммунитет и аутоиммунных заболеваний. Здесь мы описываем метод, который отличает мыши наивно CD4 + Т-клеток в клетки THGM, пропагандируемые IL-7. Итоги дифференциация оценивалась путем анализа выражения цитокинов, с использованием различных методов, включая внутриклеточных цитокинов, пятнать в сочетании с проточной цитометрии, количественных реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР), и энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА). Используя протокол дифференциация THGM как описано здесь, около 55% клеток выразил ГМ-КСФ с минимальным выражением IFNα или ил-17. Преобладающим выражение ГМ-КСФ клетками THGM далее подтверждается анализ экспрессии и ГМ-КСФ, IFNα, Ил-17 уровня мРНК и белка. Таким образом, этот метод может использоваться для различения наивно клеток CD4 + T THGM клеток в пробирке, которые будут полезны в изучении биологии клетки THGM.

Наивный CD4 + Т-клеток, изолированных от двух 8-недельных самцов мышей C57BL/6 были разделены на три части. Одна часть клеток была дифференцированной в клетки THGM после описанных протокол. Другая часть была культивированный под условие THGM присутствии антитела ант...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells at JoVE.com

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells

В пробирке Дифференциация мыши гранулоцитарно макрофагального колониестимулирующий фактор (ГМ КСФ)-производящ клетки T вспомогательный (THGM)

Здесь мы представляем протокол дифференцировать мышиных granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM) хелперы из клеток CD4 + T наивно, включая изоляции наивно CD4 + Т-клеток, дифференциация THGM, и анализ дифференцированных клеток THGM. Этот метод может применяться для изучения положения и функции клеток THGM.

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к Т-лимфоцитов

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

PiggyBac транспозонов модификации системы первичной Т-клетках человека

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Аденовирусной трансдукции наивного CD4 Т-клеток по изучению Treg Дифференциация

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Выделение и Th17 дифференцировки наивных CD4 Т-лимфоцитов

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Убийца Искусственный антигенпредставляющих клеток (KaAPC) для эффективного<em&gt; In Vitro</em&gt; Истощение человека антиген-специфических Т-клеток

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Вывод Т-клеток<em&gt; In Vitro</em&gt; От эмбриональных стволовых клеток мыши

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Мышь наивного CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток Выделение и<em&gt; В пробирке</em&gt; Дифференциация в Т-клеточных подмножеств

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Ретровирусное трансдукция Т-хелперы как генетический подход к изучению механизмов, контролирующих их дифференцировку и функции

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

In Vitro Дифференциация человеческого CD4 + FOXP3 + Индуцированные регуляторных Т - клеток (iTregs) от наивных CD4 + Т - клеток с использованием TGF-β-содержащего протокол

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...