Name: in vitro differentiation of mouse granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (gm-csf)-producing t helper (thgm) cells
Uploaded: 2018-09-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells at JoVE.com

Denna studie stöddes av bidrag från National University Health System av Singapore (T1-2014 okt-12 och T1-2015 Sep-10).

Alla möss som används i detta protokoll var på C57BL/6 genetiska bakgrunden och inrymt särskilda villkor patogenfria vid National University of Singapore. Alla experimenten utfördes med hjälp av protokoll som godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén av National University of Singapore.
1. reagens och Material förberedelse
<ol><li>Förbereda 500 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) som innehåller 2% fetalt bovint serum (FBS) och 1 mM etylendiamintetraä...

<ol>
	<li>Zhu, J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells:+fates,+functions,+and+faults.">CD4 T cells: fates, functions, and faults.</a> Blood. 112, 1557-1569 (2008).</li><li>Kara, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+immune+responses:+novel+effector+helper+T+cell+subsets+in+protective+immunity.">Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity.</a> PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).</li><li>Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Immunology+meets...Immunology:+Modified+cancer+cells+as+professional+APC+for+priming+naive+tumor-specific+CD4++T+cells.">Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells.</a> Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).</li><li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TH17+cells+in+development:+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming.">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).</li><li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17+and+Th17+Cells.">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).</li><li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT5+programs+a+distinct+subset+of+GM-CSF-producing+T+helper+cells+that+is+essential+for+autoimmune+neuroinflammation.">STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation.</a> Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).</li><li>Codarri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORgammat+drives+production+of+the+cytokine+GM-CSF+in+helper+T+cells,+which+is+essential+for+the+effector+phase+of+autoimmune+neuroinflammation.">RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation.</a> Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).</li><li>El-Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+encephalitogenicity+of+T(H)17+cells+is+dependent+on+IL-1-+and+IL-23-induced+production+of+the+cytokine+GM-CSF.">The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF.</a> Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).</li><li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17++T+helper+cells.">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126, 1121-1133 (2006).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+subset+of+helper+T+cells+promotes+immune+responses+by+secreting+GM-CSF.">A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).</li><li>Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+in+Neuroinflammation:+Licensing+Myeloid+Cells+for+Tissue+Damage.">GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage.</a> Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).</li></ol>

Här beskrivs vi ett protokoll för en in vitro- THGM differentiering från mus naiva CD4 + celler, följt av en analys av differentierade cellerna att validera metoden. Notera, kan både mjälten och lymfkörtlarna användas för naiva CD4 + T cell rening och THGM differentiering. Cytokin uttrycket bestäms av intracellulära cytokin färgning kombinerat med flödescytometri som visade att ca 55% av cellerna förmåddes att bli GM-CSF-uttryckande celler på THGM villkor (<strong...

CD4 + T helper (TH) celler är viktiga komponenter i immunsystemet, med avgörande roller i värd försvar mot mikrobiella patogener, i cancer surveillance, autoimmunitet1,2,3. Vid T-cell receptor (TCR) aktivering, naiva CD4 + T-celler kan differentieras i TH1, TH2, TH 17, eller regulatoriska T (Treg) celler under påverkan av olika cytokin FOI2,4, 5. nyligen en ny delmängd av TH celler, som huvudsakligen producerar GM-CSF, identifierades och heter THGM6. Differentiering av THGM celler drivs av IL-7 genom aktivering av en signal givare och en aktivator av transkription 5 (STAT5). Dessa celler uttrycker en stor mängd GM-CSF samtidigt ha ett lågt uttryck av andra TH-cell signatur cytokiner såsom IFNγ och IL-176. GM-CSF befanns spelar en avgörande roll i utvecklingen av CD4 + T cell-medierad neuroinflammation7,8. Jämfört med IFNγ - eller IL-17-uttryckande autoreaktiva T celler, celler GM-CSF-uttryckande T överförs till vildtyp (WT) möss orsakade en tidigare sjukdomsdebuten och högre sjukdomens svårighetsgrad. Dessutom misslyckades Csf2- / - T-celler att inducera experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) efter överförs adoptively till WT mottagare, medan T-celler saknar IFNγ eller IL-17A behållit förmågan att medla EAE7. Dessutom förbättras en blockad av GM-CSF med neutraliserande antikroppar EAE sjukdom svårighetsgrad8. Dessutom resulterade en brist på STAT5 i T-celler i möss i en minskad THGM generation, och därmed i ett motstånd av möss till EAE utveckling6. Dessa resultat understryker vikten av GM-CSF-uttryckande TH celler i autoimmuna neuroinflammatoriska sjukdomen. Således, att fastställa en metod för att skilja GM-CSF-uttryckande TH -celler från naiva CD4 + T-celler skulle vara viktigt i studien av patogenesen vid autoimmuna neuroinflammation och T cellmedierade immunsvaret. Men ett protokoll som effektivt genererar THGM celler från murina naiva CD4 + inte har fastställts.
Här presenterar vi en metod som skiljer murina THGM celler från naiva CD4 + T-celler. Det här protokollet beskriver hela förfarandet, inklusive utvinning av mjälte från musen, utarbetandet av en encellig suspension, CD4 positiva val, cellen fluorescens-aktiverat sortering (FACS) och cellen TH differentiering och analys. De differentierade T-hjälpare cellerna analyseras av intracellulära cytokin färgning kombinerade med flödescytometri att bestämma cytokin uttrycket på enskild cell nivå, genom en kvantitativ realtids-PCR att bestämma cytokin uttrycket på mRNA-nivå, och med ELISA att bedöma cytokin uttrycket på proteinnivå. Denna metod kan tillämpas på studier THGM cellbiologi under olika förhållanden, såsom EAE, där GM-CSF spelar en viktig roll i patogenesen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Heat Inactivated</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>FBS-HI-12A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-2040-10</td>
			<td>Diluted to 1x PBS in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-1053-100ml-pH8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X ACK buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td>diluted in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>93070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony SY3200 cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>Sony SY3200 cell sorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15m conical centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-0041-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human/mouse CD44 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0441-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD62L FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0621-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer-improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Trypan Blue Solution</td>
			<td>GE healthcare Life Sciences</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Elipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified&#160;anti-mouse CD3e&#160;antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified hamster anti-mouse CD28</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat&#160;anti-mouse IFN&#947; &#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>16-7312-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-mouse IL-4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>504102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-7 Protein</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>407-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-6</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>406&#8209;ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human TGF-beta</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>19-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiPlug protein transport inhibitor</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>51-2301KZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular Fixation&#38;Permeabilization buffer set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse GM-CSF PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7331-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse IL-17A</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>506908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-gamma</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO Taq qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>88-7334-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A Uncouted ELISA</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>88-7371-22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation of mouse granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (gm-csf)-producing t helper (thgm) cells

Den granulocyt-makrofag-granulocytkolonistimulerande faktorn (GM-CSF)-producerande T helper (THGM) cell är en nyligen identifierade T helper cell delmängd som huvudsakligen utsöndrar GM-CSF utan att producera interferon (IFN) γ eller interleukin (IL) -17 och finns att spela en viktig roll i de autoimmun neuroinflammation. En metod för isolering av naiva CD4 + T-celler från en enskild cell suspension av splenocytes och THGM cell generation från naiva CD4 + T-celler skulle vara en användbar teknik i studien av T-cell-medierad immunitet och autoimmuna sjukdomar. Här beskriver vi en metod som skiljer mus naiva CD4 + T-celler i THGM celler främjas av IL-7. Resultatet av differentieringen bedömdes genom analys av cytokiner uttrycket med hjälp av olika tekniker, inklusive intracellulära cytokin färgning kombinerade med flödescytometri, en kvantitativ realtids polymeras-kedjereaktion (PCR), och Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Cirka 55% av cellerna med THGM differentiering-protokollet som beskrivs här, och uttryckte GM-CSF med en minimal uttryck av IFNα eller IL-17. Dominerande uttrycket av GM-CSF genom THGM celler bekräftades ytterligare analys av uttryck för GM-CSF, IFNα och IL-17 på både mRNA och protein nivåer. Således denna metod kan användas för att differentiera naiva CD4 + T-celler till THGM celler in vitro-, som kommer att vara användbar i studiet av THGM cellbiologi.

Naiva CD4 + T-celler som isolerats från två 8-vecka-gammal manliga C57BL/6 möss delades in i tre delar. En del av cellerna var differentieras efter THGM celler efter protokollet beskrivs. En annan del var odlade under ett THGM tillstånd i närvaro av anti-IL-4 antikropp (10 µg/mL) för att testa påverkan av en IL-4 blockad i differentieringen av THGM. Den sista delen var odlade under ett TH17 differentiering tillstånd (3 µg/mL anti-CD3e,...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells at JoVE.com

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells

In Vitro Differentiering av mus granulocyt-makrofag-granulocytkolonistimulerande faktor (GM-CSF)-celler T Helper (THGM)

Här presenterar vi ett protokoll för att skilja murina granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T helper (THGM) celler från naiva CD4 + T-celler, inklusive isolering av naiva CD4 + T-celler, differentiering av THGM, och analys av differentierade THGM celler. Denna metod kan tillämpas på studier av förordningen och funktion av THGM celler.

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Riktad Differentiering av inducerade pluripotenta stamceller mot T-lymfocyter

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Adenoviral Transduktion av naiva CD4 T-celler för att studera Treg Differentiering

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolering och Th17 differentiering för naiv CD4 T-lymfocyter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificiell antigenpresenterande celler (KaAPC) för effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Utarmning av humant antigen-specifika T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Härledning av T-celler<em&gt; In Vitro</em&gt; Från Mouse embryonala stamceller

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus Naiv CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolering och<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiering i T cellundergrupper

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retroviral Transduction av Helper T-celler som en genetisk strategi för att studera mekanismer som styr deras differentiering och funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

In vitro-differentiering av humana CD4 + Foxp3 + Induced regulatoriska T-celler (iTregs) från naiva CD4 + -T-celler med ett TGF-β-innehållande protokoll

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...