Name: isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

وأيد هذا العمل "البرنامج فورون المركز الطبي الجامعي روستوك" (889018) ومؤسسة رطبة (2016-11). وبالإضافة إلى ذلك، بعد الظهر، والثالثة التي يدعمها الفدرالية (كبار الشخصيات + 00240).

هدفسكس يتم عزل من المسام الأسنان لاستخراج الحكمة الأسنان المقدمة من الإدارة عن طريق الفم والوجه والفكين جراحة التجميل في المركز الطبي في جامعة روستوك. تم الحصول على الموافقة عن علم وموافقة كتابية من جميع المرضى. إذن هذه الدراسة لجنة الأخلاقيات المحلية التابعة لجامعة روستوك (إذن برقم 2017-015...

الخلايا الجذعية البالغة حاليا في التركيز لمعالجة العديد من الأمراض التنكسية. على وجه الخصوص، العظام نخاع (بي أم)-المستمدة من الخلايا الجذعية، بما في ذلك الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) و MSCs، قيد التحقيق السريرية مكثف47. ومع ذلك، حصاد BM هو إجراء جائر تسبب الألم في موقع التبرع و...

جريب الأسنان البشرية فضفاضة المستمدة من اكتوميسينتشيمالي نسيج الضام المحيطة بالأسنان النامية1،2. إلى جانب وظيفتها تنسيق أوستيوكلاستوجينيسيس وتكون العظم لعملية اندلاع الأسنان، يأوي هذا النسيج الخلايا الجذعية، والسلف لا سيما لوضع دواعم3،،من45. ولذلك، يعتبر المسام الأسنان كمصدر بديل لحصاد الخلايا الجذعية البشرية6،7.
وأظهرت دراسات عدة أن الخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان (هدفسكس) قادرون على التفريق في نسب اللثة بما في ذلك خلايا الاوستيوبلاستس، الرباط الليفية وسيمينتوبلاستس8،،من910 . وعلاوة على ذلك، عرضت هذه الخلايا تطابق خصائص كافة الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCs) بما في ذلك القدرات الذاتية تجديد، التقيد البلاستيك، والتعبير عن علامات سطح معين (مثل، CD73، CD90، CD105) كذلك، أوستيوجينيك، أديبوجينيك وتشوندروجينيك التمايز المحتملة11،،من1213. وكشفت دراسات أخرى أيضا إمكانية تفريق العصبية هدفسكس2،،من1415،16،،من1718.
نظراً لخصائص واعدة وسهولة الوصول، أصبح هدفسكس ذات الصلة مؤخرا للأنسجة الهندسة19،،من2021. الدراسات الأولى التي ركزت على إمكانات دفسكس لتجديد العظام واللثة وجذور الأسنان19،،من2223،24،،من2526، ،من 2728،،من2930. معرفة قدرة هدفسكس العصبية، تطبيقها كعلاج محتمل لأمراض الأعصاب منذ التحقيق31،،من3233. هدفسكس اكتسبت أيضا أهمية فيما يتعلق بتجديد أخرى34،الأنسجة (ظهارة القرنيةمثلاً )35. إمكانات العلاج هدفسك لا يقوم فقط على إمكاناتهم التمايز المباشر بل أيضا على نشاطهم باراكريني. مؤخرا، أظهرت أن تفرز ثروة عوامل النشطة بيولوجيا، مثل مصفوفة ميتالوبروتيناسيس (يتولى) وعامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF)، وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية (بفجف) ويشبه الأنسولين عامل النمو (IGF) النمو تتمثل هدفسكس عامل (هجف)، التي تقوم بدور حاسم للأوعية والمرباة وإعادة عرض مصفوفة الخلوية إضافية وعمليات الترميمي36.
ومع ذلك، تأثر الترجمة السريرية واسعة النطاق للعلاج بالخلايا الجذعية لا تزال العديد من التحديات، مثل موت الخلايا الأولية الضخمة وانخفاض الخلايا الجذعية مفيدة آثار37،38. الهندسة الوراثية يوفر استراتيجية واعدة للتصدي لهذه التحديات وذلك يمكن أن يعزز الفعالية العلاجية للخلايا الجذعية البالغة38،،من3940. للتلاعب بالخلية عابرة، ميكرورناس (ميرس) مرشحين مناسبين، كما هذه الجهات المنظمة متعدية الجنسيات الصغيرة التحكم في مصير وسلوك الخلايا الجذعية دون الخطر من الجينوم مستقرة التكامل41،42، 43-وحتى الآن، حددت عدة ميرس مفيدة تعزيز انتشار الخلايا الجذعية والبقاء على قيد الحياة، وصاروخ موجه، نشاط paracrine، فضلا عن على التمايز إلى عدة الأنساب44. على سبيل المثال، المهندسة مير-133a MSCs أظهرت زيادة البقاء على قيد الحياة وانجرافتمينت في قلوب الفئران إينفاركتيد أدى تحسين وظيفة القلب عند مقارنة بغير معدلة MSCs45. وبالمثل، عرضت مير-146a overexpressing MSCs لإفراز كميات أعلى من VEGF الذي أدى بدوره إلى تعزيز كفاءة علاجية في الأنسجة الدماغية46.
ويعرض هذه المخطوطة بروتوكول مفصل لاستخراج انتقائية والهندسة الوراثية من هدفسكس. ولهذا الغرض، وصفت لنا هضم الحصاد والانزيميه تجاويف الأسنان البشرية وكذلك عزل هدفسكس اللاحقة. لوصف الخلايا المعزولة، وتعليمات هامة لتحقق خصائص ماجستير قد أدرجت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها "الجمعية الدولية" "العلاج الخلوي"13. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للجيل من تعديل مير هدفسكس بتطبيق استراتيجية الأيوني تعداء على أساس المادة الدهنية وتقييم كفاءة تعداء وسيتوتوكسيسيتي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1557A488</td>
			<td>Clone SN6, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928A488</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559883</td>
			<td>Clone MAR4, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550257</td>
			<td>Clone AD2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>339217</td>
			<td>Clone 104D2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557872</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560531</td>
			<td>Clone G44-26, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558304</td>
			<td>Clone 27-35, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90&#160;Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561557</td>
			<td>Clone 5E10, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>55095</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560777</td>
			<td>Clone HI30, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560787</td>
			<td>Clone X40, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5M, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td>0.22 &#181;m, radio-sterilized, polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17120</td>
			<td>5 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17110</td>
			<td>5nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium; Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6057-20ML</td>
			<td>histology mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS LSRII flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2011 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive dye; LIVE/DEAD&#8482; Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH: 7.4; w/o: Ca and Mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-S-G (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal medium; Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic, ZellShield</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>W 13-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter, Sterifix syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4099206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#160;mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,910,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask, 25 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,911,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium, Biofreeze</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F 2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001%</td>
			<td>Mibe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>0.9 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl satures, Vicryl rapide</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>3 - 0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells

وحتى الآن، العديد من أنواع الخلايا الجذعية في مراحل إنمائية مختلفة في التركيز على علاج الأمراض التنكسية. حتى الآن، جوانب معينة، مثل موت الخلية الأولى واسعة النطاق والآثار العلاجية منخفضة، ضعف الترجمة السريرية واسعة النطاق. الهندسة الوراثية للخلايا الجذعية قبل زرع برزت كوسيلة واعدة لتحسين الآثار العلاجية من الخلايا الجذعية. ومع ذلك، تزال تفتقر إلى نظم إيصال الجينات آمنة وفعالة. ولذلك، تطوير أساليب مناسبة قد توفر نهجاً لحل التحديات الراهنة في العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية.
يصف هذا البروتوكول استخراج وتوصيف الخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان (هدفسكس) كذلك على التحوير الوراثي غير الفيروسية. كشف النقاب عن المسام الأسنان بعد الولادة كمصدر واعدة ويمكن الوصول إليها بسهولة لحصاد الخلايا الجذعية البالغة multipotent تمتلك إمكانات عالية الانتشار. ويعرض إجراءات العزل وصف طريقة بسيطة وموثوق بها لحصاد هدفسكس من تأثير ضرس العقل. ويضم هذا البروتوكول أيضا أساليب لتحديد خصائص الخلايا الجذعية الخلايا المعزولة. للهندسة الوراثية من هدفسكس، يرد استراتيجية أمثل تعداء الأيوني على أساس المادة الدهنية مواتية ميكرورنا ذات كفاءة عالية مقدمة دون أن تسبب الآثار السامة للخلايا. ميكرورناس هي المرشحين المناسبين للتلاعب بالخلية عابرة، هذه الجهات المنظمة متعدية الجنسيات الصغيرة التحكم في مصير وسلوك الخلايا الجذعية دون خطر التكامل الجينوم مستقرة. وهكذا، يمثل هذا البروتوكول إجراء آمنة وتتسم بالكفاءة لهندسة هدفسكس التي يمكن أن تصبح مهمة لتحسين فعاليتها العلاجية.

نقدم هنا، تعليمة عزلة مفصلة لحصاد هدفسكس من الأنسجة البشرية جريب طب الأسنان. نظراً لسهولة الوصول للمسام الأسنان أثناء الجراحة الروتينية، أنها مصدرا واعداً لاستخراج الخلايا الجذعية البالغة.
هدفسكس معزولة وأظهرت جميع الخصائص الموصوفة لت...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

ويصف هذا البروتوكول الهندسة الوراثية عابر لطب الأسنان من الخلايا الجذعية المستخرجة من المسام الأسنان البشرية. الاستراتيجية التطبيقية التعديل غير الفيروسية التي قد تصبح أساسا لتحسين منتجات الخلايا الجذعية العلاجية.

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطب التجديدي، مثل حيث يمكن أن تكون الخلايا الجذعية للجريب الأسنان البشري هندستها وراثيا لتحسين خصائصها العلاجية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا الجذعية يمكن تعديلها عن طريق إدخال ميكرورنا دون خطر التكامل الجينومي المستقر. بدء عملية الهضم الأنزيمية من الجريبات اثنين، قبل الاحترار لدرجة حرارة الغرفة، الإنسان خلية جذعية جريب الأسنان أو hDFSC ثقافة المتوسطة وPBSPSG الحل.ذوبان aliquot واحد كل من كولاجيناز نوع الأول وحلول الأسهم Dispase الثاني. إعداد حل الهضم عن طريق إضافة 500 ميكرولترات من نوع كولاجيناز حل الأسهم الأول و 500 ميكرولترات من حل الأسهم Dispase II إلى 4 ملليلتر من متوسطة البازل التي تحتوي على 1٪ عامل المضادات الحيوية. لتجنب التلوث في الموقع أثناء الخلايا الجذعية عزل الخلايا الجذعية الجذعية بريب الخلايا البشرية يجب أن تحتوي وسائل الإعلام المستخدمة على عوامل المضادات الحيوية.ضع بصيلات الأسنان المستخرجة في طبق بيتري معقمة. إضافة 10 ملليلتر من حل PBSPSG لغسل الأنسجة المستخرجة. التعرق وتجاهل الحل وإضافة حل PBSPSG جديدة لتكرار غسل.باستخدام مشرط مشرط معقم مستخرجة بصيلات إلى قطع إذا كان حوالي 1 في 1 ملليمتر. نقل الأنسجة المفروم وPBSPSG حل من طبق بيتري في أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 50 ملليلتر، وغسل طبق بيتري مع 10 ملليلتر من حل PBSPSG، ونقل الحل في نفس الأنبوب. الطرد المركزي أنبوب المخروطية في 353 س ز في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق.إضافة 5 ملليلتر من حل الهضم إلى الأنسجة المنصة، بلطف خلط الحل والأنسجة، واحتضان الخليط في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة اهتزاز لمدة ساعتين. بعد ساعتين، الطرد المركزي تعليق الخلية والأنسجة المهضمة في 353 غرام لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل عظمى وإعادة تعليق البليت التي تم الحصول عليها في 6 ملليلتر من HDFSC ثقافة المتوسطة.بذور تعليق الخلية في قارورة ثقافة خلية 25 سم مربع، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية. بعد حصاد الخلية وتوصيف HDFSC هو كما هو موضح في بروتوكول النص، hDFSCs البذور في 24 جيدا خلية لوحة ثقافة. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 20٪ أوكسجين لمدة 24 ساعة.في اليوم التالي تمييع 40 picomoles من ميكرورنا في 66.7 ميكرولترات من متوسطة المصل مخفضة، ودوامة الحل. تمييع 0.67 ميكرولترات من الدهون الموجبة على أساس، كاشف transfection في 66.7 ميكرولترات من متوسطة المصل مخفضة، دوامة الحل، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق إضافة microRNA قبللوت إلى كاشف إعادة الإرسال قبللوت، مزيج الحل، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس عشرة دقيقة.بعد ذلك، إضافة تعقيدات transfection المعدة، dropwise، مباشرة إلى الوسط ثقافة على الخلايا. مزيج بلطف عن طريق هزاز 24 لوحة ثقافة الخلية جيدا ذهابا وإيابا. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.بعد 24 ساعة من عملية الانتـرـض، جمع المـاكر من العينات في أنابيب أجهزة الطرد المركزي المخروطية ذات الـ 15 ملليلتر. اغسل الخلايا بـ 1 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، ونقل برنامج تلفزيوني إلى أنبوب الطرد المركزي المعني. إضافة 500 ميكرولترات من التنقيط وEDTA إلى الخلايا، واحتضان لوحة 24 جيدا في 37 درجة مئوية، لمدة 3 دقائق.وقف التربسيناتية عن طريق إضافة 1 ملليلتر من خلية ثقافة المتوسطة للخلايا، ونقل الحل إلى أنبوب الطرد المركزي المعنية. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 س ز و 4 درجات مئوية لمدة عشر دقائق. من هنا فصاعدا الحفاظ على الخلايا والكواشف على الجليد ما لم يذكر خلاف ذلك.تجاهل supernatant، resuspend الخلايا في 100 ميكرولترات من المخازل تلطيخ، ونقل حل الخلية إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 ملليلتر. إضافة 0.5 ملليلتر من صبغة رد الفعل أمين لكل عينة من أجل التمييز بين الخلايا الحية والميت. خلط بلطف الحل، واحتضان في 4 درجات مئوية لمدة عشر دقائق.إضافة 1 ملليلتر من برنامج تلفزيوني إلى الخلايا، والطرد المركزي في 300g و 4 درجات مئوية لمدة عشر دقائق تجاهل الخلايا الفائقة و resuspend في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، إضافة 33 ميكرولترات من paraformaldehyde، وخلط الحلول، وتخزين العينات في 4 درجات مئوية محمية من الضوء حتى تدفق القياسات السيتونية. نقل العينات إلى أنابيب مناسبة لقياسات تدفق السيتوميترية، وتنفيذ عملية التتمتري التدفق باستخدام استراتيجية الغاتة الموصوفة في بروتوكول النص. أظهرت الخلايا الجذعية لجريب الأسنان البشري المعزول جميع الخصائص الموصوفة لتعريف الخلايا السترومية المتوسطة ، وكانت الخلايا من البلاستيك الملتمسة وعرضت الألياف الزجاجية مثل مورفولوجيا ، في ظل ظروف الثقافة القياسية.وكشف التحليل السيتري للتدفق أن مراكز التحلل (hDFSCs) قد عبرت عن لوحة من مستضدات سطحية معينة، بما في ذلك CD29 و CD44 و CD73 و CD90 و CD105. بينما كان CD45 وDC117 غائبة. أكّدت ال [إدبوجيني], [أوستيوثين], و [غندروين] تمايز إمكانيات من خلايا تحت خاصّة في فيترو ثقافة شروط كان ب [إينتّر] مناعة, بروتين [دّكّي] ربط ل: [أوستيوكالسين], و [أغريكن].استراتيجية الغاء المستخدمة في القياس الكمي للسمية الخلوية وCy3 المسمى microRNA كفاءة امتصاص 24 ساعة بعد transfection، وأكد امتصاص ميكرورنا في 100٪ من الخلايا القابلة للحياة. وتشير كميات مماثلة من الخلايا الميتة في العينات المصابة بالعدوى وغير المنقولة إلى أن ميكرورنا يتم إدخالها بكفاءة دون آثار سمية للخلايا. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ أساليب أخرى مثل التمايز من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل اللدونة Cytolab.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

هندسة العوامل الاصطناعي للتلاعب على وجه التحديد الربط البديل في الخلايا البشرية

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

جيل تعطيل الجينات العقدية mutans سلالة دون الجيني الاستنساخ

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

نظم التأسيسي وإيندوسيبلي للتعديل الوراثي في فيفو من خلايا الكبد الماوس باستخدام حقن الوريد ذيل هيدرودينامية

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

اتباع نهج خلية واحدة اندماجي لتوصيف الجزيئية والتغاير إيمونوفينوتيبيك الجذعية البشرية والسكان السلف

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

البروتين الذاتية في الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent باستخدام كريسبر/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

عزل، وتسلسلها، وتحليل MicroRNAs خارج الخلية من الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

إعداد وتعديل الجينات الرئيسيات نونومان الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...