Name: isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

这项工作得到了罗斯托克大学医疗中心 forun 方案 (889018) 和 damp 基金会 (2016-11) 的支持。此外, pm. 和 r. d. 还由 bmbf (vip + 00240) 提供支持。

hdfsc 是从罗斯托克大学医学中心口腔颌面整形外科提供的拔牙智齿毛囊中分离出来的。所有患者均获得了知情同意和书面批准。这项研究得到了罗斯托克大学地方道德委员会的授权 (批准号: 2017-0158号)。
1. hdfsc 的分离
请注意:为了防止细菌污染, 在拔除前不应爆发智齿
<ol><li>
准备所需的解决方案
	<ol>
<li>制备磷酸盐缓冲盐水 (pbs)/...

成人干细胞目前是治疗几种退行性疾病的重点。特别是骨髓 (bm) 衍生干细胞, 包括造血干细胞 (hsc) 和骨髓间充质干细胞, 正在进行密集的临床调查47。然而, bm 收获是一种侵入性的程序, 在捐赠地点引起疼痛, 并可能导致不良事件48。最近, 产后牙齿组织已成为一种新的、易于获取的干细胞来源。这些牙科干细胞被证明符合 msc 的所有特性, 并显示出更高的增殖能力?...

人牙囊是一个松散的外皮衍生结缔组织周围的发展中的牙齿 1,2。除了协调骨分裂和成骨的功能, 牙齿爆发过程中, 该组织窝藏和祖细胞, 特别是为牙周组织 3,4,5的发展。因此, 牙囊被认为是收获人类成人干细胞6,7的替代来源。
几项研究表明, 人类牙囊干细胞 (hdfsc) 能够分化为牙周系, 包括成骨细胞、韧带成纤维细胞和骨板8,9,10.此外, 这些细胞被证明符合间充质间质间质细胞 (mscs) 的所有特征, 包括自我更新能力, 塑料粘附, 特定表面标记物的表达 (如 cd73, cd90, cd105), 以及成骨,脂原和软骨分化潜力11,12,13。其他研究还揭示了 hdfsc2、14、15、16、17、18的神经分化潜力。
由于其具有广阔的特性和易于访问, hdfsc 最近与组织工程19、20、21 相关.第一批研究集中于 dfsc 再生骨、牙周和牙根的潜力19、22、23、24、25、26、 27,28,29,30。自从了解 hdfsc 的神经源性能力以来, 对其作为神经退行性疾病潜在治疗方法的应用进行了 31、32、33项研究。hdfsc 在其他组织 (如角膜上皮) 的再生方面也变得越来越重要,34,35。hdfsc 的治疗潜力不仅取决于其直接分化潜力, 还取决于其副分泌活性。最近, hdfsc 已被证明分泌了大量的生物活性因子, 如基质金属蛋白酶 (mmp)、胰岛素样生长因子 (igf)、血管内皮生长因子 (vegf)、碱性成纤维细胞生长因子 (bfgf) 和肝细胞生长因子 (hgf), 在血管生成、免疫调节、额外细胞基质重塑和修复过程中起着至关重要的作用36。
然而, 干细胞治疗的广泛临床翻译仍然受到几个挑战的损害, 如大规模初始细胞死亡和低有益干细胞效应37,38。基因工程为应对这些挑战提供了一个很有希望的策略, 因此可以大大提高干细胞的治疗效果 38、39、40.对于瞬态细胞操作, 微 rna (miRs) 是合适的候选, 因为这些小的平移调节剂控制干细胞的命运和行为, 而不会受到稳定基因组整合的危险 41,42,43. 迄今为止, 已确定了若干有益的 miRs, 以促进干细胞增殖、存活、归巢、辅助治疗活动以及它们被分化为几个血统44。例如, 与未经修饰的 mscs 45 相比, miR-133a 工程 mscs在梗死大鼠心脏中的存活率和植入物增加, 从而改善了心功能。同样, miR-146a 过度表达骨髓间充质干细胞被证明会分泌更多的 vegf, 这反过来又提高了缺血组织46的治疗效率。
本文详细介绍了 hdfsc 的选择性提取和基因工程。为此, 我们描述了人类毛囊的收获和酶消化, 以及随后 hdfsc 的分离。为了确定分离细胞的特征, 根据国际细胞治疗协会13的准则, 列入了核查海安会特性的重要说明。此外, 我们还应用阳离子脂质转染策略, 并对转染效率和细胞毒性进行评价, 对 mirr 改性 hdfsc 的产生进行了详细的描述。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1557A488</td>
			<td>Clone SN6, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928A488</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559883</td>
			<td>Clone MAR4, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550257</td>
			<td>Clone AD2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>339217</td>
			<td>Clone 104D2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557872</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560531</td>
			<td>Clone G44-26, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558304</td>
			<td>Clone 27-35, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90&#160;Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561557</td>
			<td>Clone 5E10, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>55095</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560777</td>
			<td>Clone HI30, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560787</td>
			<td>Clone X40, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5M, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td>0.22 &#181;m, radio-sterilized, polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17120</td>
			<td>5 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17110</td>
			<td>5nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium; Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6057-20ML</td>
			<td>histology mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS LSRII flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2011 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive dye; LIVE/DEAD&#8482; Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH: 7.4; w/o: Ca and Mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-S-G (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal medium; Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic, ZellShield</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>W 13-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter, Sterifix syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4099206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#160;mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,910,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask, 25 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,911,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium, Biofreeze</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F 2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001%</td>
			<td>Mibe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>0.9 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl satures, Vicryl rapide</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>3 - 0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells

迄今为止, 不同发育阶段的几种干细胞类型是治疗退行性疾病的重点。然而, 某些方面, 如最初的大规模细胞死亡和低治疗效果, 损害了他们广泛的临床翻译。移植前干细胞基因工程是优化治疗性干细胞效应的一种有前途的方法。然而, 仍然缺乏安全和有效的基因传递系统。因此, 开发合适的方法可以为解决目前干细胞疗法中的挑战提供一种途径。
本协议描述了人类牙囊干细胞 (hdfsc) 的提取和表征及其非病毒遗传修饰。产后毛囊公布, 作为一个有希望的和容易获得的来源, 收获具有高增殖潜力的成人多能干细胞。所述的隔离过程提供了一种简单可靠的方法来从受影响的智齿中获取 hdfsc。该协议还包括定义分离细胞干细胞特性的方法。对于 hdfsc 的基因工程, 提出了一种优化的阳离子脂质转染策略, 可在不产生细胞毒性影响的情况下实现高效的微 rna 导入。微 rna 是瞬态细胞操作的合适选择, 因为这些小的平移调节剂控制干细胞的命运和行为, 而不会受到稳定基因组整合的危害。因此, 该协议代表了 hdfsc 的一个安全和有效的工程过程, 这可能成为重要的优化其治疗效果。

在这里, 我们提出了一个详细的隔离说明, 以收获 hdfsc 从人类毛囊组织。由于在常规手术中容易获得牙囊, 它是提取成人干细胞的一个很有前途的来源。
分离的 hdfsc 显示了 msc13定义所描述的所有特征。事实上, 细胞在描述的培养条件下是塑料-粘附物, 并显示出类似于成纤维细胞的形态 (图 1</stro...

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Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

该协议描述了从人毛囊中提取的牙干细胞的瞬态基因工程。应用的非病毒性修饰策略可以为治疗性干细胞产品的改进奠定基础。

人牙小泡干细胞的分离、鉴定及微 rna 遗传修饰

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

这种方法可以帮助回答再生医学领域的关键问题，例如人类牙泡干细胞可以进行基因工程，以提高其治疗性能。该技术的主要优点是，干细胞可以通过微RNA引入进行修饰，而不会带来稳定的基因组整合的危险。开始两个卵泡的酶消化程序，通过预热到室温，人类牙卵泡干细胞或hDFSC培养基和PBSPSG溶液。解冻一个等分，每个胶原蛋白类型 I 和 Dispase II 库存解决方案。通过将500微升的胶原酶 I 型库存溶液和 500 微升的 Dispase II 库存溶液添加到含有 1% 抗生素剂的 4 毫升基础介质中，准备消化液。为避免在人类牙齿卵泡干细胞隔离洗涤缓冲液和培养剂期间发生现场污染，必须含有抗生素制剂。将提取的牙泡放在无菌培养皿中。加入10毫升的PBSPSG溶液，清洗提取的组织。吸气并丢弃溶液，并添加新鲜的 PBSPSG 溶液以重复洗涤。使用无菌手术刀肉末提取的毛囊成片，如果约1由1毫米。将切碎的组织和 PBSPSG 溶液从培养皿转移到 50 毫升锥形离心管中，用 10 毫升 PBSPSG 溶液清洗 Petri 盘，然后将溶液转移到同一管中。在室温下以 353 x g 离心锥形管 10 分钟。在托盘组织中加入5毫升的消化溶液，轻轻混合溶液和组织，在37摄氏度和5%CO2的摇培养箱中孵育混合物两个小时。两小时后，将消化的细胞和组织悬浮液在353克下离心10分钟。丢弃上流剂，并在 HDFSC 培养介质的 6 毫升中重新悬挂获得的托盘。在25平方厘米的细胞培养瓶中播种细胞悬浮液，并在37摄氏度下孵育细胞。在细胞收获和HDFSC表征后，如文本协议所述，在24个井细胞培养板中播种hDFSC。在37摄氏度、5%CO2和20%氧气下孵育24小时。第二天，在66.7微升的血清介质中稀释40个微RNA，并涡旋溶液。稀释0.67微升的阳离子脂基，转染试剂在66.7微升的减少血清介质，涡流溶液，并在室温下孵育五分钟。五分钟后，将预稀释的微RNA加入预稀释的转染试剂中，混合溶液，在室温下孵育15分钟。接下来，将准备好的转染复杂性直接添加到细胞上的培养培养中。通过来回摇动24个井细胞培养板轻轻混合。在37摄氏度下孵育细胞24小时。转染后24小时，在各15毫升锥形离心管中收集样品的上一代。用 1 毫升 PBS 清洗细胞，然后将 PBS 转移到各自的离心管中。将500微升滴水和EDTA加入细胞，在37摄氏度下孵育24井板3分钟。通过为细胞添加1毫升细胞培养培养，并将溶液转移到各自的离心管中，停止三辛化。在300 x g和4摄氏度下将细胞离心10分钟。从这里开始，除非另有说明，否则将细胞和试剂留在冰上。丢弃上流剂，将细胞重新填充在100微升染色缓冲液中，将细胞溶液转移到1.5毫升微离心管中。在每个样品中加入0.5毫升胺反应染料，以区分活细胞和死细胞。轻轻混合溶液，在4摄氏度下孵育10分钟。向细胞中加入1毫升PBS，在300g和4摄氏度的离心机下10分钟丢弃上清液，将细胞重新加到100微升PBS中，加入33微升的甲醛，混合溶液，将样品储存在4摄氏度的高温下，防止光，直到流式测光。将样品转移到适合流式细胞测量的管中，并使用文本协议中描述的浇注策略执行流式细胞测量。分离的人类牙卵泡干细胞显示了为定义间质性细胞而描述的所有特征，细胞是塑料粘附体，在标准培养条件下显示出一种玻璃纤维，如形态。流细胞测量分析显示，hDFSCs表示一组某些表面抗原，包括CD29、CD44、CD73、CD90和CD105。CD45 和 CD117 缺席。在特定的体外培养条件下，细胞的致生、骨源和成体分化潜力得到免疫污染（一种脂肪酸结合蛋白：骨钙素和Aggrecan）的证实。用于细胞毒性和Cy3的定量的浇注策略在转染后24小时标记了微RNA吸收效率，确认100%的存活细胞中微RNA吸收。转染和未转染样品中可比数量的死细胞表明，微RNA的引入没有细胞毒性效应。按照此过程，可以执行其他方法，如转样，以回答其他问题，如细胞实验室可塑性。

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

工程人为因素来特异性地操纵人细胞中的选择性剪接

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

科研

遗传学

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA 修饰的免疫: 共焦图像的计算分析

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

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无基因克隆的基因破坏的变形链球菌菌株的生成

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

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人骨髓间充质干细胞细胞外微 rna 的分离、测序和分析

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

非人类灵长类动物造血干细胞和祖细胞的制备及基因修饰

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...