Name: isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af programmet FORUN Rostock University Medical Center (889018) og den FUGTIGE Foundation (2016-11). Derudover P.M. og R.D. understøttes af BMBF (VIP + 00240).

HDFSCs er isoleret fra dental follikler af uddraget visdom tænder fra afdeling for Oral og Maxillofacial plastikkirurgi i Rostock University Medical Center. Informeret samtykke og skriftlig godkendelse blev opnået fra alle patienter. Denne undersøgelse blev godkendt af det lokale etiske udvalg af Universitet i Rostock (tilladelse No. A 2017-0158).
1. isolering af hDFSCs
Bemærk: For at forhindre bakteriel forurening, bør ikke være udbrød visdom ...

Voksne stamceller er i øjeblikket i fokus til behandling af flere degenerative sygdomme. Især knogle marv (BM)-afledte stamceller, herunder hæmatopoietisk stamceller (HSCs) og MSC'er, er under intensiv kliniske undersøgelse47. Dog BM høst er en invasiv procedure, forårsager smerter i stedet for donation og kan føre til utilsigtede hændelser48. For nylig, den postnatale dental væv er opstået som en roman og let tilgængelig kilde til stamceller. Disse dental stamce...

Den menneskelige dental hårsækken er en løs ectomesenchymally-afledte bindevæv omkring den tredje tand1,2. Ved siden af sin funktion at koordinere osteoclastogenesis og osteogenesis for tand vulkanen proces, havne denne væv stilk og stamfader celler især for udviklingen af parodontiet3,4,5. Derfor, dental hårsækken er betragtes som en alternativ kilde til høst menneskelige stamceller fra voksne6,7.
Flere undersøgelser viste, at menneskelige dental follikel stamceller (hDFSCs) er i stand til at differentiere i parodontale slægt herunder osteoblaster, ligament fibroblaster og cementoblasts8,9,10 . Desuden, disse celler blev vist til at matche alle Karakteristik af mesenchymale stromale celler (MSCs) herunder selvstændig fornyelse kapacitet, overholdelse af plast, udtryk for specifikke overflade markører (f.eks., CD73, CD90, CD105) så godt som osteogenic, adipogenic og chondrogenic differentiering potentielle11,12,13. Andre undersøgelser viste også et neurale differentiering potentiale af hDFSCs2,14,15,16,17,18.
På grund af deres lovende egenskaber og nem adgang blev hDFSCs for nylig relevante for tissue engineering19,20,21. De første undersøgelser koncentreret om DFSCs potentiale til at regenerere knogle, parodontale og tand rødder19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Viden om neurogen evne til hDFSCs, deres anvendelse som potentiel behandling af neurodegenerative sygdomme siden undersøgte31,32,33. HDFSCs har også fået betydning med hensyn til den regenerering af andre væv (fx hornhindens epitel)34,35. Det terapeutiske potentiale i hDFSC er ikke kun baseret på deres direkte differentiering potentiale, men også på deres paracrine aktivitet. For nylig har hDFSCs vist sig at udskille et væld af bioaktive faktorer, såsom matrix metalloproteinases (MMPs), insulin-lignende vækstfaktor (IGF), vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), basic fibroblast vækstfaktor (bFGF) og hepatocyt vækst faktor (HGF), som spiller en afgørende rolle for angiogenese, immunomodulation, ekstra cellulære matrix remodellering og reparative processer36.
Dog er bred klinisk oversættelse af stamcelleterapi stadig svækket af flere udfordringer, såsom massive indledende celledød og lav gavnlige stamcelle effekter37,38. Genteknologien giver en lovende strategi for at imødegå disse udfordringer og derfor kan i høj grad øge den terapeutiske virkning af stamceller38,39,40. For forbigående celle manipulation er MicroRNA (miRs) egnede kandidater, som disse små translationel tilsynsmyndigheder styrer den skæbne og opførsel af stamceller uden fare for stabil genom integration41,42, 43. til dato, der er konstateret flere gavnlige miRs fremme stamcelle spredning, overlevelse, målsøgende, paracrine aktivitet samt deres differentiering i flere slægter44. For eksempel, manipuleret miR-133a MSCs viste en øget overlevelse og engraftment i infarcted rotte hjerter resulterer i en forbedret hjertefunktion sammenlignet med ikke-modificerede MSC'er45. Ligeledes, miR-146 overekspression MSCs blev vist til at udskille større mængder af VEGF, hvilket igen førte til en øget terapeutisk effektivitet i iskæmiske væv46.
Dette manuskript præsenterer en detaljeret protokol for selektiv ekstraktion og gensplejsning af hDFSCs. Til dette formål beskrev vi høst og enzymatiske fordøjelsen af menneskelige dental follikler og den efterfølgende isolation af hDFSCs. For at karakterisere isolerede celler, er vigtige instruktioner til verifikation af MSC egenskaber medtaget i overensstemmelse med retningslinjerne fra det internationale samfund for cellulære terapi13. Derudover giver vi en detaljeret beskrivelse af generation af miR-ændret hDFSCs ved at anvende en kationiske lipid-baserede Transfektion strategi og evalueringen af Transfektion effektivitet og cytotoksicitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1557A488</td>
			<td>Clone SN6, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928A488</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559883</td>
			<td>Clone MAR4, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550257</td>
			<td>Clone AD2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>339217</td>
			<td>Clone 104D2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557872</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560531</td>
			<td>Clone G44-26, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558304</td>
			<td>Clone 27-35, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90&#160;Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561557</td>
			<td>Clone 5E10, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>55095</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560777</td>
			<td>Clone HI30, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560787</td>
			<td>Clone X40, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5M, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td>0.22 &#181;m, radio-sterilized, polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17120</td>
			<td>5 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17110</td>
			<td>5nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium; Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6057-20ML</td>
			<td>histology mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS LSRII flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2011 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive dye; LIVE/DEAD&#8482; Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH: 7.4; w/o: Ca and Mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-S-G (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal medium; Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic, ZellShield</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>W 13-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter, Sterifix syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4099206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#160;mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,910,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask, 25 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,911,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium, Biofreeze</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F 2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001%</td>
			<td>Mibe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>0.9 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl satures, Vicryl rapide</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>3 - 0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells

Til dato, er flere stamcelle typer på forskellige udviklingsstadier i fokus for behandlingen af degenerative sygdomme. Men visse aspekter, såsom indledende massiv celledød og lave terapeutiske virkninger, forringet deres bred klinisk oversættelse. Gensplejsning af stamceller før transplantation fremstod som en lovende metode til at optimere terapeutisk stamceller effekter. Sikker og effektiv gen leveringssystemer mangler dog stadig. Derfor, udvikling af egnede metoder kan give en tilgang til at løse aktuelle udfordringer i stamcelle-baseret terapi.
Denne protokol beskriver udvinding og karakterisering af menneskelige dental follikel stamceller (hDFSCs) samt deres ikke-virale genetisk modifikation. Den postnatale dental follikel afsløret som en lovende og let tilgængelig kilde til høst Multipotente stamceller fra voksne besidder høj spredning potentiale. Proceduren beskrevet isolation præsenterer en enkel og pålidelig metode til at høste hDFSCs fra påvirket visdom tænder. Denne protokol omfatter også metoder til at definere stamcelle Karakteristik af isolerede celler. Genteknologi i hDFSCs præsenteres en optimeret kationiske lipid-baserede Transfektion strategi aktivering højeffektive mikroRNA Introduktion uden at forårsage cytotoksiske virkninger. MicroRNA er egnede kandidater til forbigående celle manipulation, da disse små translationel tilsynsmyndigheder styrer den skæbne og opførsel af stamceller uden fare for stabil genom integration. Denne protokol udgør således, en sikker og effektiv procedure for konstruktion af hDFSCs, der kan blive vigtigt for at optimere deres terapeutiske virkning.

Vi præsenterer her, en detaljeret isolation instruktion til at høste hDFSCs fra menneskelige dental hårsækken væv. På grund af den nemme adgang af dental hårsækken under rutinemæssig operation er det en lovende kilde til udvinding af stamceller fra voksne.
Den isolerede hDFSCs viste alle karakteristika som beskrevet for definitionen af MSCs13. I virkeligheden var celler plast-tilhænger under bes...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Denne protokol beskriver den forbigående genteknologi af dental stamceller udvundet af menneskelige dental hårsækken. Anvendt ikke-virale modifikation-strategien kan blive grundlag for forbedring af terapeutisk stamceller produkter.

Isolation, karakterisering og mikroRNA-baseret genetisk modificering af menneskelige Dental follikel stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for regenerativ medicin, såsom hvor en human tandsækken stamceller kunne være genetisk manipuleret til at forbedre deres terapeutiske egenskaber. Den største fordel ved denne teknik er, at stamceller kan ændres ved microRNA introduktion uden fare for stabil genom integration. Begynd proceduren for enzymatisk fordøjelse af de to follikel, ved pre-opvarmning til stuetemperatur, human tandsæk stamcelle eller hDFSC kultur medium og PBSPSG løsning.Tø en aliquot hver af Collagenase type I og Dispase II lager løsninger. Forbered en fordøjelsesopløsning ved at tilføje 500 mikroliter af Kollagentype I-lageropløsningen og 500 mikroliter af Dispase II-stockopløsningen til 4 milliliter Basal Medium, der indeholder 1 %antibiotisk middel. For at undgå forurening på stedet under humane tandsækken stamcelle isolation vask buffere og kultur medier, der anvendes skal indeholde antibiotikamidler.Placer en ekstraudvundet tandsækken i en steril petriskål. Tilsæt 10 milliliter PBSPSG opløsning til vask af det ekstraherede væv. Indsugning og kassér opløsningen, og tilsæt frisk PBSPSG-opløsning for at gentage vasken.Ved hjælp af en steril skalpel hakkekød den ekstraherede follikel i stykker, hvis omkring 1 af 1 millimeter. Den hakkede vævs- og PBSPSG-opløsning overføres fra petriskålen til et 50 milliliterkonisk centrifugerør, petriskålen vaskes med 10 milliliter PBSPSG-opløsning, og opløsningen overføres til samme rør. Centrifuge det koniske rør ved 353 x g ved stuetemperatur i ti minutter.Tilsæt 5 milliliter fordøjelsesopløsning til det pallede væv, bland forsigtigt opløsningen og vævet, inkubere blandingen ved 37 grader celsius og 5% CO2 i en rystende inkubator i to timer. Efter to timer centrifugeres den fordøjede celle og vævssuspensionen ved 353 g i ti minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten, og ophæng den opnåede palle igen i 6 milliliter HDFSC-kulturmedium.Frø celle suspension i en 25 kvadratcentet cellekultur kolbe, og inkubere cellerne ved 37 grader celsius. Efter cellehøst og karakterisering af HDFSC er som beskrevet i tekstprotokollen, frø hDFSCs i en 24 godt cellekultur plade. Inkuberes ved 37 grader celsius, 5% CO2 og 20% Oxygen i 24 timer.Den følgende dag fortyndes 40 picomoler microRNA i 66,7 mikroliter reduceret serummedium, og vortex opløsningen. Fortyndet 0,67 mikroliter af kationisk lipid baseret, transfektion reagens i 66,7 mikroliter af reduceret serum medium, vortex opløsningen, og inkubere ved stuetemperatur i fem minutter. Efter fem minutter tilsættes det præediluterede microRNA til det præediluterede transinfektionsreagens, opløsningen blandes og inkuberes ved stuetemperatur i femten minutter.Dernæst tilføjes de forberedte transfektionskompleksiteter, dropwise, direkte til kulturmediet på celler. Bland forsigtigt ved at rokke de 24 brøndcellekulturplade frem og tilbage. Inkuber cellerne ved 37 grader celsius i 24 timer.24 timer efter transfektionen udtages supernatanten af prøver i de respektive koniske centrifugerør med 15 milliliter. Cellerne vaskes med 1 milliliter PBS, og overfør PBS til det respektive centrifugerør. Tilsæt 500 mikroliter drypper og EDTA til cellerne, og inkuber 24 brøndpladen ved 37 grader celsius i 3 minutter.Stop trypsiniseringen ved at tilføje 1 milliliter cellekulturmedium til cellerne og overføre opløsningen til det respektive centrifugerør. Centrifuge cellerne ved 300 x g og 4 grader celsius i ti minutter. Herfra opbevares cellerne og reagenserne på is, medmindre andet er angivet.Kassér supernatanten, opslæm cellerne i 100 mikroliter af farvningsbuffer, og overfør celleopløsningen til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Der tilsættes 0,5 milliliter reaktivt stofstof til hver prøve for at skelne mellem levende og døde celler. Bland forsigtigt opløsningen, og inkuberes ved 4 grader celsius i ti minutter.Tilsæt 1 milliliter PBS til cellerne, og centrifuge ved 300g og 4 grader celsius i ti minutter Kassér supernatanten og resuspenderede cellerne i 100 mikroliter PBS, tilsæt 33 mikroliter paraformaldehyd, og bland opløsningerne, opbevar prøverne ved 4 grader celsius beskyttet mod lysstrøm indtil cytmetric målinger. Overfør prøverne til rør, der er egnede til flowcytometriske målinger, og udfør flowcytometri ved hjælp af den gatingstrategi, der er beskrevet i tekstprotokollen. De isolerede humane tandsækken stamceller viste alle egenskaber beskrevet for definitionen af mesenkymale stromale celler, celler var plast klæbende og viste et glasfiber som morfologi, under standard kultur betingelser.Flow cytometrisk analyse viste, at hDFSCs udtrykte et panel af visse overfladeantigener, herunder CD29, CD44, CD73, CD90 og CD105. Mens CD45 og CD117 var fraværende. Cellernes adipogene, osteogene og chondrogeniske differentieringspotentialer under specifikke in vitro-kulturbetingelser blev bekræftet ved immunstaining, et fedtsyrebindende protein til:Osteocalcin og Aggrecan.Den gatingstrategi, der anvendes til kvantificering af cytotoksicitet og Cy3 mærket mikroRNA-optagelseseffektivitet 24 timer efter transfektion, bekræftet mikroRNA-optagelse i 100% af levedygtige celler. Sammenlignelige mængder døde celler i transficerede og ikke-transmitte prøver indikerer, at microRNA indføres effektivt uden cytotoksiske virkninger. Efter denne procedure, andre metoder såsom transdifferentiering kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål som Cytolab plasticitet.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Tekniske kunstige faktorer til specifikt manipulation af alternativ splejsning i humane celler

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunfarvning for DNA ændringer: beregningsmæssige analyse af Konfokal billeder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation af en gen-forstyrret Streptococcus mutans stamme uden Gene kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstituerende og inducerbar systemer for genetiske In Vivo ændring af mus hepatocytter brug af hydrodynamiske hale vene injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-kvantitative opdagelse af RNA-afhængige RNA Polymerase aktivitet af menneskelige Telomerase Reverse transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Højeffektive gen afbrydelse af Murine og menneskelige hæmatopoietisk stamceller ved CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

En kombinatorisk encellede tilgang til at karakterisere de molekylære og Immunophenotypic heterogenitet af menneskelige stamceller og stamfader populationer

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging i menneskelige induceret pluripotente stamceller ved hjælp af CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, sekventering og analysere ekstracellulære MicroRNA fra humane mesenkymale stamceller

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Forberedelse og gen modifikation af ikkemenneske primat hæmatopoietisk stamceller og stamceller

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...