Name: isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het programma van de FORUN van het Rostock universitair medisch centrum (889018) en de VOCHTIGE Foundation (2016-11). Daarnaast P.M. en R.D. worden ondersteund door de goedgekeurd (VIP + 00240).

HDFSCs zijn geïsoleerd van de tandheelkundige follikels uitgepakte verstandskiezen geboden door het departement van orale en maxillofaciale plastische chirurgie van het Rostock University Medical Center. Geïnformeerde toestemming en schriftelijke toestemming is verkregen van alle patiënten. Deze studie werd gemachtigd door de lokale ethische commissie van de Universiteit van Rostock (No. A 2017-0158 toestemming).
1. isolatie van hDFSCs
Opmerking: V...

Volwassen stamcellen zijn momenteel in focus voor de behandeling van verschillende degeneratieve ziekten. In het bijzonder, beenmerg (BM)-afgeleid van stamcellen, met inbegrip van hematopoietische stamcellen (HSCs) en de MSCs, onder intensieve klinisch onderzoek47. BM oogsten is echter een invasieve procedure veroorzaken van pijn op de site van donatie en kan leiden tot ongewenste voorvallen48. Onlangs, het postnatale tandheelkundige weefsel heeft ontpopt als een roman en g...

De menselijke tandheelkundige follikel is een losse ectomesenchymally afkomstige bindweefsel rondom de ontwikkelende tand1,2. Naast zijn functie om osteoclastogenesis en osteogenesis voor de tand uitbarsting proces te coördineren, herbergt dit weefsel cellen van de stam en voorlopercellen vooral voor de ontwikkeling van het parodontium3,4,5. De tandheelkundige follikel is derhalve als een alternatieve financieringsbron te oogsten menselijke adulte stamcellen6,7.
Verschillende studies aangetoond dat stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel (hDFSCs) geschikt zijn voor differentiatie in de parodontale afkomst, met inbegrip van botcellen, ligament fibroblasten en cementoblasts8,9,10 . Bovendien, deze cellen werden getoond aan alle kenmerken van mesenchymale stromale cellen (MSCs) met inbegrip van zichzelf vernieuwende capaciteit, de naleving van de plastic, expressie van specifieke oppervlakte markers (b.v., CD73, CD90, CD105) zo goed als osteogenic, adipogenic en chondrogenic differentiatie potentiële11,12,13. Andere studies bleek ook een potentieel van de neurale differentiatie van hDFSCs2,14,15,16,17,18.
Als gevolg van hun veelbelovende eigenschappen en gemakkelijke toegang werd hDFSCs onlangs relevant voor weefsel engineering19,20,21. De eerste studies geconcentreerd op het potentieel van DFSCs voor de regeneratie van bot, parodontale en tand wortels19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Sinds de kennis van de neurogene vermogen van hDFSCs, is hun toepassing als mogelijke behandeling voor neurodegeneratieve ziekten onderzochte31,32,33. HDFSCs hebben ook opgedaan belang met betrekking tot het herstel van andere weefsels (bijvoorbeeld hoornvlies epitheel)34,35. De therapeutische mogelijkheden van hDFSC is niet alleen gebaseerd op hun directe differentiatie mogelijkheden maar ook op hun paracrine activiteit. Onlangs, hDFSCs is aangetoond dat het afscheiden van een schat aan bioactieve factoren, zoals matrix metalloproteinasen (MMP), insuline-achtige groei factor (IGF), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), fundamentele fibroblast groeifactor (bFGF) en hepatocyte groei factor (HGF), die een cruciale rol voor de angiogenese, immunomodulatie, extra cellulaire matrix remodelleren en herstellend processen36.
Brede klinische vertaling van stamcel therapie is echter nog steeds aangetast door verschillende uitdagingen, zoals massale eerste celdood en37,38van de effecten van de lage positieve cel van de stam. Genetische manipulatie biedt een veelbelovende strategie om deze problemen aan te pakken en daarom kan sterk verbeteren van de therapeutische werking van stamcellen38,39,40. Voor tijdelijke cel manipulatie zijn microRNAs (miRs) geschikte kandidaten, omdat deze kleine translationeel toezichthouders controle de lotgevallen en het gedrag van stamcellen zonder het gevaar van stabiele genoom integratie41,42, 43. tot op heden verschillende heilzame miRs geconstateerd bevordering van stam celproliferatie, overleving, homing, paracrine activiteit, evenals hun differentiatie in verscheidene geslachten44. Bijvoorbeeld, ontworpen miR-133a MSCs toonde een hogere overleving en de engraftment in infarcted rat hart wat resulteert in een verbeterde cardiale functie wanneer vergeleken bij ongewijzigde van de MSCs45. MiR-146a overexpressing MSCs werden ook getoond om hogere bedragen van VEGF die op zijn beurt geleid tot een verbeterde therapeutische efficiëntie in ischemische weefsel46afscheiden.
Dit manuscript presenteert een gedetailleerd protocol voor de selectieve extractie en genetische manipulatie van hDFSCs. Voor dit doel beschreven we de oogsten en enzymatische vertering van menselijke tandheelkundige follikels en de daaropvolgende Isolatievan hDFSCs. Om het karakteriseren van geïsoleerde cellen, zijn belangrijke aanwijzingen voor de verificatie van MSC eigenschappen opgenomen overeenkomstig de richtsnoeren van de International Society for cellulaire therapie13. Daarnaast bieden wij een gedetailleerde beschrijving voor de generatie van miR gemodificeerde hDFSCs door toepassing van een strategie van kationische lipide gebaseerde transfectie en de evaluatie van de efficiëntie van de transfectie en cytotoxiciteit.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1557A488</td>
			<td>Clone SN6, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928A488</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559883</td>
			<td>Clone MAR4, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550257</td>
			<td>Clone AD2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>339217</td>
			<td>Clone 104D2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557872</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560531</td>
			<td>Clone G44-26, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558304</td>
			<td>Clone 27-35, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90&#160;Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561557</td>
			<td>Clone 5E10, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>55095</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560777</td>
			<td>Clone HI30, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560787</td>
			<td>Clone X40, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5M, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td>0.22 &#181;m, radio-sterilized, polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17120</td>
			<td>5 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17110</td>
			<td>5nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium; Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6057-20ML</td>
			<td>histology mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS LSRII flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2011 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive dye; LIVE/DEAD&#8482; Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH: 7.4; w/o: Ca and Mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-S-G (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal medium; Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic, ZellShield</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>W 13-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter, Sterifix syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4099206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#160;mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,910,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask, 25 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,911,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium, Biofreeze</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F 2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001%</td>
			<td>Mibe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>0.9 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl satures, Vicryl rapide</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>3 - 0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells

Tot op heden, zijn de verschillende types van de stamcel op verschillende ontwikkelingsstadia in de focus voor de behandeling van degeneratieve ziekten. Echter verminderde bepaalde aspecten, zoals de eerste massale celdood en lage therapeutische effecten, hun brede klinische vertaling. Genetische manipulatie van stamcellen voorafgaand aan de transplantatie naar voren gekomen als een veelbelovende methode voor het optimaliseren van de cel van de stam van de therapeutische effecten. Gen van de veilige en efficiënte levering systemen zijn echter nog steeds ontbreekt. Daarom kan de ontwikkeling van geschikte methoden biedt een aanpak om op te lossen van de huidige uitdagingen in stamcel gebaseerde therapieën.
Dit protocol beschrijft de extractie en de karakterisatie van menselijke tandheelkundige follikelstimulerend stamcellen (hDFSCs) en hun niet-virale genetische modificatie. De postnatale tandheelkundige follikel onthuld als een veelbelovende en gemakkelijk toegankelijke bron voor het oogsten van adulte multipotente stamcellen hoge proliferatie potentieel bezitten. De procedure beschreven isolatie presenteert een eenvoudige en betrouwbare methode om te oogsten hDFSCs van beïnvloed wijsheid tanden. Dit protocol bevat ook methoden om te definiëren van de kenmerken van de cel van de stam van geïsoleerde cellen. Voor genetische manipulatie van hDFSCs, wordt een geoptimaliseerde kationische lipide gebaseerde transfectie strategie gepresenteerd waardoor hoogefficiënte microRNA Inleiding zonder cytotoxische effecten. MicroRNAs zijn geschikte kandidaten voor voorbijgaande cel manipulatie, omdat deze kleine translationeel toezichthouders controle de lotgevallen en het gedrag van stamcellen zonder het gevaar van stabiele genoom integratie. Dit protocol vormt aldus, een veilige en efficiënte procedure voor de engineering van hDFSCs die belangrijk zijn voor het optimaliseren van hun therapeutische werking kan worden.

Hier presenteren we een gedetailleerd isolatie instructie om te oogsten van de hDFSCs van menselijke tandheelkundige follikel weefsel. Als gevolg van de gemakkelijke toegang van de tandheelkundige follikel tijdens een routine-operatie is het een veelbelovende bron voor de winning van volwassen stamcellen.
De geïsoleerde hDFSCs toonde alle kenmerken voor de definitie van MSCs13beschreven. In feite, cellen...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Dit protocol beschrijft de voorbijgaande genetische manipulatie van tandheelkundige stamcellen gewonnen uit de menselijke tandheelkundige follikel. De toegepaste niet-virale wijziging strategie kan een basis voor de verbetering van de cel van de stam van de therapeutische producten geworden.

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van regeneratieve geneeskunde, zoals waar een menselijke tandzak stamcellen genetisch kunnen worden gemanipuleerd om hun therapeutische eigenschappen te verbeteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat stamcellen kunnen worden gewijzigd door microRNA introductie zonder het gevaar van stabiele genoomintegratie. Begin met de procedure voor enzymatische vertering van de twee follikel, door voorverwarmen tot kamertemperatuur, menselijke tandzakstamcel of hDFSC-kweekmedium en PBSPSG-oplossing.Ontdooi een aliquot elk van Collagenase type I en Dispase II voorraad oplossingen. Bereid een spijsverteringsoplossing voor door 500 microliter van de Collagenase type I-voorraadoplossing en 500 microliter van de Dispase II-voorraadoplossing toe te voegen aan 4 milliliter basalmedium met 1%antibioticum. Om besmetting op de plaats tijdens menselijke tandzakzakstamcelisolatie te voorkomen, moeten de gebruikte kweekmiddelen antibiotica bevatten.Plaats een geëxtraheerd tandzak in een steriel petrischaaltje. Voeg 10 milliliter PBSPSG-oplossing toe om het geëxtraheerde weefsel te wassen. Aspirate en gooi de oplossing weg en voeg verse PBSPSG-oplossing toe om de was te herhalen.Met behulp van een steriele scalpel gehakt de geëxtraheerde follikel in stukken als ongeveer 1 bij 1 millimeter. Breng het gehakte weefsel en PBSPSG-oplossing van de petrischaal in een 50 milliliter conische centrifugebuis, was de petrischaal met 10 milliliter PBSPSG-oplossing en breng de oplossing in dezelfde buis. Centrifuge de conische buis op 353 x g bij kamertemperatuur gedurende tien minuten.Voeg 5 milliliter spijsverteringsoplossing toe aan het gepalleteerde weefsel, meng de oplossing en het weefsel voorzichtig, broed het mengsel twee uur lang uit bij 37 graden Celsius en 5% CO2 in een schuddende couveuse. Na twee uur, centrifugeren de verteerde cel en weefsel suspensie op 353 g gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant weg en hang de verkregen pallet opnieuw op in 6 milliliter HDFSC-kweekmedium.Zaad de cel suspensie in een 25 vierkante centimeter cel cultuur fles, en incubeer de cellen op 37 graden Celsius. Na cel oogst en karakterisering van HDFSC is zoals beschreven in de tekst protocol, zaad hDFSCs in een 24 goed celkweekplaat. Incubeer bij 37 graden celsius, 5%CO2 en 20%Zuurstof gedurende 24 uur.Op de volgende dag verdun 40 picomoles van microRNA in 66.7 microliter van verminderd serummiddel, en draaikolk de oplossing. Verdun 0,67 microliter kationisch lipidegebaseerd, transfectiereagensagemiddel in 66,7 microliter van verlaagd serummedium, vortex de oplossing en incuboïde vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg na vijf minuten het voorverdunde microRNA toe aan het voorverdunde transfectiereagens, meng de oplossing en broed gedurende vijftien minuten bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens de voorbereide transfectiecomplexiteiten, dropwise, direct toe aan het kweekmedium op cellen. Meng zachtjes door het schommelen van de 24 goed cel cultuur plaat heen en weer. Broed de cellen 24 uur lang in op 37 graden Celsius.24 uur na de transfectie, verzamel de supernatant van monsters in respectievelijk 15 milliliter conische centrifugebuizen. Was de cellen met 1 milliliter PBS en breng de PBS over in de respectievelijke centrifugebuis. Voeg 500 microliter druppels en EDTA toe aan de cellen en broed de 24 putplaat uit op 37 graden Celsius, gedurende 3 minuten.Stop de trypsinisatie door 1 milliliter celkweekmedium voor de cellen toe te voegen en de oplossing over te brengen naar de respectievelijke centrifugebuis. Centrifugeren de cellen op 300 x g en 4 graden celsius gedurende tien minuten. Vanaf hier houden de cellen en reagentia op ijs, tenzij anders vermeld.Gooi de supernatant weg, zet de cellen opnieuw op in 100 microliter kleuringsbuffer en breng de celoplossing over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Voeg 0,5 milliliter amine reactieve kleurstof toe aan elk monster om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen. Meng de oplossing voorzichtig en broed gedurende tien minuten uit op 4 graden Celsius.Voeg 1 milliliter PBS toe aan de cellen, en centrifuge bij 300g en 4 graden Celsius gedurende tien minuten Gooi de supernatant weg en zet de cellen opnieuw op in 100 microliter van PBS, voeg 33 microliter paraformaldehyde toe en meng de oplossingen, bewaar de monsters op 4 graden Celsius beschermd tegen licht tot stroom cytometrische metingen. Breng de monsters over naar buizen die geschikt zijn voor cytometrische metingen en voer stroomcytometrie uit met behulp van de gatingstrategie die in het tekstprotocol wordt beschreven. De geïsoleerde menselijke tandzakstamcellen toonden alle kenmerken die voor de definitie van mesenchymale stromalcellen worden beschreven, de cellen waren plastichangend en toonden een glasvezel zoals morfologie, onder standaardcultuurvoorwaarden.Flow cytometrische analyse bleek dat hDFSCs uitgedrukt een paneel van bepaalde oppervlakte antigenen, waaronder CD29, CD44, CD73, CD90, en CD105. Terwijl CD45 en CD117 afwezig waren. De adipogene, osteogene en chondrogene differentiatie mogelijkheden van cellen onder specifieke In Vitro kweekomstandigheden werd bevestigd door immunostaining, een vetzuur bindend eiwit voor: Osteocalcin, en Aggrecan.De gating strategie die wordt gebruikt voor de kwantificering van cytotoxiciteit en Cy3 gelabelde microRNA opname-efficiëntie 24 uur na transfectie, bevestigde microRNA opname in 100% van de levensvatbare cellen. Vergelijkbare hoeveelheden dode cellen in transfectede en onverzettede monsters geven aan dat microRNA efficiënt wordt geïntroduceerd zonder cytotoxische effecten. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals transdifferentiatie, om aanvullende vragen zoals Cytolab-plasticiteit te beantwoorden.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generatie van een gen-verstoord Streptococcus mutans stam zonder Gene klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutieve en afleidbare systemen voor genetische In Vivo wijziging van muis hepatocyten gebruik hydrodynamische staart veneuze injectie

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Voorbereiding en genetische modificatie van Nonhuman primaat hematopoietische stamcellen en voorlopercellen

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...