Name: isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch das FORUN-Programm von Rostock University Medical Center (889018) und der feuchten Foundation (2016-11) unterstützt. Darüber hinaus ist Uhr und r.d. werden durch das BMBF (VIP + 00240) unterstützt.

HDFSCs sind isoliert die zahnmedizinische Follikel der extrahierte Weisheitszähne, die von der Abteilung für Mund- und plastische Gesichtschirurgie des Universitätsklinikum Rostock zur Verfügung gestellt. Einwilligung nach Aufklärung und schriftliche Genehmigung wurde von allen Patienten erhalten. Diese Studie wurde von der lokalen Ethikkommission der Universität Rostock (Erlaubnis No. A 2017-0158) ermächtigt.
1. Isolierung der hDFSCs
Hinweis: ...

Adulte Stammzellen sind derzeit im Fokus für die Behandlung von verschiedenen degenerativen Erkrankungen. Vor allem Knochenmark (BM)-Stammzellen, einschließlich hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) abgeleitet und MSCs, intensive klinische Untersuchung47unterliegen. Allerdings BM Ernte ist ein invasives Verfahren verursachen Schmerzen an der Stelle der Spende und kann zu unerwünschten Ereignissen48führen. Vor kurzem hat die postnatale Zahngewebe eine neuartige und leicht...

Die menschlichen zahnmedizinische Follikel ist eine lose Ectomesenchymally abgeleitet Bindegewebe rund um den dritten Zahn1,2. Neben seiner Funktion, Osteoclastogenesis und Osteogenesis für den Zahn-Ausbruch-Prozess zu koordinieren birgt dieses Gewebe Stamm- und Vorläuferzellen Zellen vor allem für die Entwicklung des Parodonts3,4,5. Daher gilt die zahnmedizinische Follikel als alternative Energiequelle menschliche adulte Stammzellen6,7zu ernten.
Mehrere Studien bewiesen, dass menschliche dental follikelstimulierendes Stammzellen (hDFSCs) in der Lage, Differenzierung in der parodontalen Linie einschließlich der Osteoblasten, Fibroblasten Bänder- und Cementoblasts8,9,10 . Darüber hinaus diese Zellen erwiesen sich alle Merkmale des mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) einschließlich selbst erneuernde Kapazität, Einhaltung von Kunststoff, Ausdruck der spezifischen Oberflächenmarker übereinstimmen (z. B., CD73, CD90, CD105) sowie als osteogene adipogenen und Chondrogenic Differenzierung möglicher11,12,13. Andere Studien zeigten auch eine neuronale Differenzierung Potenzial von hDFSCs2,14,15,16,17,18.
Aufgrund ihrer vielversprechenden Eigenschaften und einfachen Zugang wurde hDFSCs vor kurzem relevant für Tissue engineering19,20,21. Die ersten Studien konzentrierten sich auf das Potenzial der DFSCs, Knochen, parodontale Regeneration und Zahn Wurzeln19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Seit das Wissen der neurogenen Fähigkeit des hDFSCs ist ihre Anwendung als potenzielle Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen untersuchten31,32,33. HDFSCs haben auch Bedeutung in Bezug auf die Regeneration des anderen Geweben (z.B. Hornhaut-Epithel)34,35. Das therapeutische Potenzial von hDFSC basiert nicht nur auf ihre direkte Differenzierung Potenzial, sondern auch auf ihre parakrine Aktivität. Vor kurzem haben hDFSCs gezeigt, dass eine Fülle von bioaktive Faktoren, wie Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und Hepatozyten Wachstum absondern Faktor (HGF), die eine entscheidende Rolle bei der Angiogenese, Immunmodulation, extra zellulären Matrix Modellierung und reparative Prozesse36spielen.
Breite klinische Übersetzung der Stammzell-Therapie ist jedoch immer noch durch verschiedene Herausforderungen, wie massive erste Zelltod und niedrigen positiven Stammzellen Effekte37,38beeinträchtigt. Gentechnik stellt eine vielversprechende Strategie zur Bewältigung dieser Herausforderungen und können daher erheblich verbessern die therapeutische Wirksamkeit von Stammzellen38,39,40. Für vorübergehende Zelle Manipulation sind Micro-RNAs (MiRs) geeignete Kandidaten, wie diese kleinen translationale Regler, das Schicksal und das Verhalten von Stammzellen ohne die Gefahr von stabilen Genom Integration41,42, Steuern 43. bisher mehrere vorteilhafte MiRs identifiziert wurden Stamm Zellproliferation, überleben, Homing, parakrine Aktivität sowie deren Differenzierung in verschiedene Linien44zu fördern. MiR-133a entwickelt beispielsweise MSCs zeigte ein verlängertes Überleben und Engraftment aufrecht, wodurch eine verbesserte Herzfunktion im Vergleich zu unveränderten MSCs45Rattenherzen. Ebenso zeigten MiR-146a überexprimierenden MSCs höhere Mengen an VEGF absondern, was wiederum zu einer verbesserten therapeutischen Effizienz im ischämischen Gewebe46geführt.
Diese Handschrift enthält ein detailliertes Protokoll für die selektive Extraktion und gentechnische Veränderung von hDFSCs. Zu diesem Zweck haben wir die Ernte- und enzymatische Verdauung von menschlichen zahnmedizinische Follikel sowie die nachträgliche Isolierung der hDFSCs beschrieben. Um isolierte Zellen zu charakterisieren, wurden wichtige Hinweise für die Überprüfung der MSC Eigenschaften gemäß den Richtlinien der International Society for Zellulartherapie13aufgenommen. Darüber hinaus bieten wir eine ausführliche Beschreibung zur Erzeugung von MiR modifiziert hDFSCs durch die Anwendung einer kationischen Lipid-basierte Transfektion Strategie und die Bewertung der Effizienz der Transfektion und Zytotoxizität.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1557A488</td>
			<td>Clone SN6, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928A488</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559883</td>
			<td>Clone MAR4, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550257</td>
			<td>Clone AD2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>339217</td>
			<td>Clone 104D2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557872</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560531</td>
			<td>Clone G44-26, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558304</td>
			<td>Clone 27-35, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90&#160;Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561557</td>
			<td>Clone 5E10, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>55095</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560777</td>
			<td>Clone HI30, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560787</td>
			<td>Clone X40, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5M, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td>0.22 &#181;m, radio-sterilized, polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17120</td>
			<td>5 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17110</td>
			<td>5nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium; Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6057-20ML</td>
			<td>histology mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS LSRII flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2011 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive dye; LIVE/DEAD&#8482; Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH: 7.4; w/o: Ca and Mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-S-G (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal medium; Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic, ZellShield</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>W 13-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter, Sterifix syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4099206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#160;mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,910,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask, 25 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,911,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium, Biofreeze</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F 2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001%</td>
			<td>Mibe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>0.9 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl satures, Vicryl rapide</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>3 - 0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells

Bis heute sind mehrere Stammzelltypen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien im Fokus für die Behandlung von degenerativen Erkrankungen. Jedoch beeinträchtigt bestimmte Aspekte wie anfängliche massive Zelltod und geringen therapeutischen Wirkungen, ihre breite klinische Übersetzung. Gentechnische Veränderung von Stammzellen vor der Transplantation erwies sich als eine vielversprechende Methode zur therapeutischen Stammzellen Effekte optimieren. Sichere und effiziente gen-Delivery-Systeme fehlen jedoch noch. Daher kann die Entwicklung geeigneter Methoden einen Ansatz zur Lösung der aktuellen Herausforderungen stammzellbasierte Therapien bieten.
Dieses Protokoll beschreibt die Gewinnung und Charakterisierung von menschlichen dental follikelstimulierendes Stammzellen (hDFSCs) sowie ihre nicht-viralen genetischen Veränderung. Die postnatale zahnmedizinische Follikel enthüllt als vielversprechende und leicht zugängliche Quelle für die Ernte von multipotenten Stammzellen besitzen hohe Verbreitung Potenzial. Die beschriebenen Isolierung-Verfahren stellt eine einfache und zuverlässige Methode zur hDFSCs von Weisheitszähne Ernte. Dieses Protokoll umfasst auch Methoden zur Stammzell-Merkmale der isolierten Zellen definieren. Für gentechnische Veränderung von hDFSCs ist eine optimierte kationischen Lipid-basierte Transfektion Strategie ermöglicht hocheffiziente MicroRNA-Einführung vorgelegt, ohne zytotoxische Wirkungen verursacht. Micro-RNAs sind geeignete Kandidaten für vorübergehende Zelle Manipulation, wie diese kleinen translationale Regler das Schicksal und das Verhalten von Stammzellen ohne die Gefahr der stabilen Genom Integration zu kontrollieren. Dieses Protokoll stellt ein sicheres und effizientes Verfahren zur Konstruktion von hDFSCs, die wichtig für die Optimierung ihrer therapeutischen Wirksamkeit werden können.

Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Isolierung Anleitung hDFSCs aus menschlichen zahnmedizinische Follikel Gewebe zu ernten. Aufgrund der Anbindung des zahnmedizinischen Follikels während der routinemäßigen Operation ist es eine vielversprechende Quelle für die Gewinnung von adulten Stammzellen.
Die isolierten hDFSCs zeigte alle Merkmale für die Definition von MSCs13beschrieben. In der Tat...

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Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Dieses Protokoll beschreibt der Transienten Gentechnik zahnmedizinische Stammzellen aus der menschlichen zahnmedizinische Follikel extrahiert. Die angewandte nicht-viralen Modifikation Strategie kann eine Grundlage für die Verbesserung der therapeutischen Stammzellen Produkte geworden.

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Regenerativen Medizin zu beantworten, wie z. B. wo ein menschlicher Zahnfollikel Stammzellen gentechnisch verändert werden könnte, um ihre therapeutischen Eigenschaften zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Stammzellen durch die Einführung von microRNA ohne die Gefahr einer stabilen Genomintegration modifiziert werden können. Beginnen Sie das Verfahren zur enzymatischen Verdauung der beiden Follikel, durch Vorerwärmung auf Raumtemperatur, menschliche Zahnfollikel Stammzelle oder hDFSC Kulturmedium und PBSPSG-Lösung.Thaw ein aliquot jede von Collagenase Typ I und Dispase II Aktienlösungen. Bereiten Sie eine Verdauungslösung vor, indem Sie 500 Mikroliter der Lagerlösung Kollagenase Typ I und 500 Mikroliter der Dispase II-Lagerlösung auf 4 Milliliter Basal Medium mit 1% Antibiotika enthalten. Um eine Kontamination der Standorte während der menschlichen Zahnfollikel-Stammzellisolation zu vermeiden, müssen Waschpuffer und verwendete Kulturmedien Antibiotika enthalten.Legen Sie einen extrahierten Zahnfollikel in eine sterile Petrischale. Fügen Sie 10 Milliliter PBSPSG-Lösung hinzu, um das extrahierte Gewebe zu waschen. Aspirieren und entsorgen Sie die Lösung und fügen Sie frische PBSPSG-Lösung hinzu, um die Wäsche zu wiederholen.Mit einem sterilen Skalpell zerkleinern Sie den extrahierten Follikel in Stücke, wenn etwa 1 mal 1 Millimeter. Das Hackfleisch und die PBSPSG-Lösung aus der Petrischale in ein 50-Milliliter-Konzentrigerohr geben, die Petrischale mit 10 Milliliter PBSPSG-Lösung waschen und in ein und dasselbe Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 353 x g bei Raumtemperatur für zehn Minuten.5 Milliliter Verdauungslösung in das palettenGewebe geben, die Lösung und das Gewebe vorsichtig mischen, die Mischung bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 in einem Schüttelinkubator für zwei Stunden inkubieren. Nach zwei Stunden zentrifugieren Sie die verdaute Zelle und Gewebesuspension bei 353 g für zehn Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie die erhaltene Palette in 6 MilliliterHDSC-Kulturmedium wieder auf.Säen Sie die Zellsuspension in einem 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben, und brüten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Nach der Zellernte und Charakterisierung von HDFSC ist wie im Textprotokoll beschrieben, Samen hDFSCs in einer 24 Well-Zell-Kulturplatte. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius, 5% CO2 und 20% Sauerstoff für 24 Stunden.Am folgenden Tag 40 Picomole von microRNA in 66,7 Mikroliter reduziertem Serummedium verdünnen und die Lösung wirbeln. Verdünnen Sie 0,67 Mikroliter kationisches Lipid-basiertes Transfektionsreagenz in 66,7 Mikroliter reduziertem Serummedium, Wirbel der Lösung und inkubieren Bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Nach fünf Minuten die vorverdünnte microRNA in das vorverdünnte Transfektionsreagenz geben, die Lösung mischen und bei Raumtemperatur 15 Minuten brüten.Als nächstes fügen Sie die vorbereiteten Transfektionskomplexitäten tropfenweise direkt zum Kulturmedium auf Zellen hinzu. Mischen Sie sanft, indem Sie die 24 Brunnenzellkulturplatte hin und her schaukeln. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden.24 Stunden nach der Transfektion den Überstand der Proben in den jeweiligen 15 Milliliter-Konifugenrohren sammeln. Waschen Sie die Zellen mit 1 Milliliter PBS und übertragen Sie die PBS in das jeweilige Zentrifugenrohr. Fügen Sie 500 Mikroliter Tropf und EDTA in die Zellen, und brüten die 24 Brunnenplatte bei 37 Grad Celsius, für 3 Minuten.Beenden Sie die Trypsinisierung, indem Sie 1 Milliliter Zellkulturmedium für die Zellen hinzufügen und die Lösung in das jeweilige Zentrifugenrohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g und 4 Grad Celsius für zehn Minuten. Von hier aus halten Sie die Zellen und Reagenzien auf Eis, sofern nicht anders angegeben.Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter Neinen Desstrich wieder auf und übertragen Sie die Zelllösung in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 0,5 Milliliter Amin-Reaktivfarbstoff zu jeder Probe hinzu, um zwischen lebenden und abgestorbenen Zellen zu unterscheiden. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, und brüten bei 4 Grad Celsius für zehn Minuten.Fügen Sie 1 Milliliter PBS zu den Zellen hinzu, und Zentrifuge bei 300g und 4 Grad Celsius für zehn Minuten Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter PBS wieder auf, fügen Sie 33 Mikroliter Paraformaldehyd hinzu und mischen Sie die Lösungen, speichern Sie die Proben bei 4 Grad Celsius, geschützt vor Licht, bis zytometrische Messungen durch den Fluss. Übertragen Sie die Proben in Röhren, die für zytometrische Durchflussmessungen geeignet sind, und führen Sie die Durchflusszytometrie mithilfe der im Textprotokoll beschriebenen Gating-Strategie durch. Die isolierten menschlichen Zahnfollikelstammzellen zeigten alle für die Definition mesenchymaler Stromalzellen beschriebenen Eigenschaften, Zellen waren kunststoffhaft und zeigten eine Glasfaser-ähnliche Morphologie unter Standardkulturbedingungen.Die zytometrische Analyse des Flusses ergab, dass hDFSCs ein Panel mit bestimmten Oberflächenantigenen exprimiert haben, einschließlich CD29, CD44, CD73, CD90 und CD105. Während CD45 und CD117 fehlten. Die adipogenen, osteogenen und chondrogenen Differenzierungspotenziale von Zellen unter spezifischen In-Vitro-Kulturbedingungen wurden durch Immunfärbung, ein Fettsäure-Bindendes Protein für:Osteocalcin und Aggrecan, bestätigt.Die Gating-Strategie für die Quantifizierung der Zytotoxizität und Cy3 markiert microRNA Aufnahme Effizienz 24 Stunden nach der Transfektion, bestätigte microRNA Aufnahme in 100% der lebensfähigen Zellen. Vergleichbare Mengen abgestorbener Zellen in transfizierten und untransfizierten Proben deuten darauf hin, dass microRNA effizient ohne zytotoxische Wirkungen eingeführt wird. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Transdifferenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Cytolab Plastizität zu beantworten.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Forschung

Genetik

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Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

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Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

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Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

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Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

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A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

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Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen

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Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Vorbereitung und gentechnische Veränderung von Nichtmenschen Primas hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...